Summary
Vi presenterar steg-för-steg-instruktioner för generering av neonatal chimärer samt dissekering och förberedelse av bräss för ex vivo imaging med 2-Photon mikroskopi.
Abstract
Två-foton mikroskopi (TPM) ger oss möjlighet att bilden djupt in i tymus och dokumentera händelser som är viktiga för tymocyt utveckling. För att följa migrationen av individer i en folkmassa av tymocyter skapar vi neonatal chimärer där mindre än en procent av tymocyter kommer från en donator som är transgena för en ubiquitously uttrycka fluorescerande protein. För att generera dessa partiella hematopoetisk chimärer, är neonatal mottagare injiceras med benmärg mellan 3-7 dagars ålder. Efter 4-6 veckor är musen offras och bräss är noggrant dissekeras och bissected bevara arkitekturen i den vävnad som ska avbildas. Bräss är limmad på ett täckglas som förberedelse för ex vivo avbildning av TPM. Under avbildning bräss hålls i DMEM utan fenolrött som är perfusion med 95% syrgas och 5% koldioxid och uppvärmd till 37 ° C. Med denna metod kan vi studera de händelser som krävs för generering av en mängd T-cell repertoar.
Protocol
Adoptiv transfer
Injicera nyfödda med 50-100ul av benmärg med en spruta 2-4 gånger under de första 3-7 dagarna av liv, med en sista givare till host 1:1. Sikta på ett injektionsställe nedanför bröstbenet och bröstkorgen, men framför tarmen och magen. In nålen tillräckligt långt för att tränga igenom bukhinnan, noga med att inte punktera membranet. Det är inte ovanligt för en del av benmärgen att gå förlorade under injektionen. Du kan minska förlusten genom att lossa greppet om valpen när du injicera så att huden att expandera och då långsamt att ta bort nålen.
Dissektion av Thymus
Gör ett snitt genom mittlinjen och skär eller riva huden bort att avslöja bröstkorgen. Håll i bröstbenet och skär genom bukhinnan och mellangärde. Skär upp sidorna av bröstkorgen för att avslöja brösthålan. Bräss ligger på toppen av hjärtat. I syfte att bevara strukturen på bräss, hålla fast vid omgivande vävnad som du dissekera ut bräss. Skölj bräss med PBS för att hålla den från att torka ut under dissekering. Försiktigt reta bort överflödig vävnad på ytan av thymic kapseln och HALVERA de två lober.
Förbereda Mjukpapper för bildbehandling
Använd veterinär vävnad lim för att limma bräss nej till en kvadrat täckglas. Använd en pipetteman att sätta en bråkdel av en mikroliter lim. Sprid lim till den ungefärliga längden och bredden på bräss. Steady bräss mot täckglas och dra den på plats.
Två-Photon Imaging
Vävnaden är nedsänkt i DMEM utan fenolrött som är perfusion med 95% syrgas och 5% koldioxid och uppvärmd till 37 ° C. Två-foton excitation uppnåddes med hjälp av en Spectra-Physics Maitai lasern inställd på 900nm, och den gemensamma fiskeripolitiken, GFP, YFP och Texas Red utsläpp ljus var separeras med en 495, 515, 560 dikroiskt speglar och in med PMT detektorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Två-foton avbildning i tymus ger oss möjlighet att undersöka i levande, intakta organ interaktionen och migration som ligger bakom valet händelser inom bräss.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi tackar Matt Paul och Jimmy Wu för tekniskt stöd.
References
- Kyewski, Seeding of thymic microenvironments defined by distinct thymocyte-stromal cell interactions is developmentally controlled. J Exp Med. 166, 520-538 (1987).
- Ladi, E., Yin, X., Chtanova, T., Robey, E. A. Thymic microenvironments for T cell differentiation and selection. Nat Immunol. 7, 338-343 (2006).
- Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. Directed Migration of Positively Selected Thymocytes Visualized in Real Time. PLoS Biol. 3, (2005).
