Summary
We presenteren stap-voor-stap instructies voor het genereren van neonatale hersenschimmen, alsmede de dissectie en voorbereiding van de thymus voor ex vivo beeldvorming door 2-Photon Microscopie.
Abstract
Twee-foton microscopie (TPM) stelt ons in staat om de afbeelding diep in de thymus en document de gebeurtenissen die belangrijk zijn voor thymocyt ontwikkeling. Het volgen van de migratie van individuen in een menigte van thymocyten, genereren we neonatale hersenschimmen, waar minder dan een procent van de thymocyten zijn afgeleid van een donor die transgeen voor een rode draad te drukken fluorescerend eiwit. Voor het genereren van deze gedeeltelijke hematopoëtische hersenschimmen, zijn neonatale ontvangers geïnjecteerd met beenmerg tussen de 3-7 dagen oud zijn. Na 4-6 weken, wordt de muis gedood en de thymus wordt zorgvuldig ontleed en bissected het behoud van de architectuur van het weefsel dat zal worden afgebeeld. De thymus is gelijmd op een dekglaasje aan ter voorbereiding van ex vivo beeldvorming van TPM. Tijdens beeldvorming van de thymus wordt gehouden in DMEM zonder fenol rood dat is geperfuseerd met 95% zuurstof en 5% kooldioxide en verwarmd tot 37 ° C. Met deze aanpak kunnen we bestuderen de gebeurtenissen die nodig zijn voor het genereren van een divers T-cel repertoire.
Protocol
Adoptieve overdracht
Injecteren neonaten met 50-100ul van beenmerg met behulp van een insuline spuit 2-4 keer tijdens de eerste 3-7 dagen van het leven, met een uiteindelijke donor-to-host-verhouding van 1:1. Streven naar een injectie onder het borstbeen en ribbenkast, maar boven de darmen en maag. Steek de naald ver genoeg om het buikvlies, Pas op dat u doorboren het membraan dringen. Het is niet ongewoon dat een deel van het beenmerg om verloren tijdens de injectie. U kunt het verlies door het losdraaien van uw grip op de pup als je zo injecteren zijn dat de huid uit te breiden en, vervolgens, langzaam het verwijderen van de naald.
Dissectie van Thymus
Maak een incisie door de middellijn en het knippen of afscheuren van de huid aan de ribbenkast te onthullen. Houd vast aan het borstbeen en snijd door het buikvlies en het middenrif. Knip de zijkanten van de ribbenkast naar de borstholte te onthullen. De thymus ligt op de top van het hart. Dus als de structuur van de thymus te bewaren, vasthouden aan het omliggende weefsel als je ontleden de thymus. Spoel de zwezerik met PBS te houden tegen uitdroging tijdens de dissectie. Zachtjes weg te pesten overtollige weefsel op het oppervlak van de thymus capsule en halveren de twee lobben.
Voorbereiden Tissue for Imaging
Gebruik veterinaire weefsel lijm op lijm van de thymus nee tegen een vierkant dekglaasje aan. Gebruik een pipetteman tot een fractie van een microliter van lijm te zetten. Verspreid de lijm aan de lengte en de breedte van de thymus. Steady de thymus tegen het dekglaasje en sleep deze op zijn plaats.
Two-Photon Imaging
Het weefsel is ondergedompeld in DMEM zonder fenol rood dat is geperfuseerd met 95% zuurstof en 5% kooldioxide en verwarmd tot 37 ° C. Twee-foton excitatie werd bereikt met behulp van een Spectra-Physics Maitai laser afgestemd op 900nm, en CFP, GFP, YFP en Texas Red-emissie licht was gescheiden met behulp van een 495, 515, 560 dichroïsche spiegels en verzameld met behulp van PMT detectoren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Twee-foton beeldvorming in de thymus stelt ons in staat om na te gaan in het leven, intacte organen de interacties en migraties die selectie ten grondslag liggen aan gebeurtenissen in de thymus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Wij danken Matt Paul en Jimmy Wu voor technische bijstand.
References
- Kyewski, Seeding of thymic microenvironments defined by distinct thymocyte-stromal cell interactions is developmentally controlled. J Exp Med. 166, 520-538 (1987).
- Ladi, E., Yin, X., Chtanova, T., Robey, E. A. Thymic microenvironments for T cell differentiation and selection. Nat Immunol. 7, 338-343 (2006).
- Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. Directed Migration of Positively Selected Thymocytes Visualized in Real Time. PLoS Biol. 3, (2005).
