Summary

Culture primaire de cellules souches de la pulpe dentaire

Published: May 05, 2023
doi:

Summary

Cet article fournit un guide par étapes pour établir une culture primaire de cellules souches de pulpes dentaires à l’aide de la méthode de culture d’explants et la caractérisation de ces cellules basée sur les directives de l’ICSCRT. Les cellules isolées par ce protocole peuvent être considérées comme des cellules souches mésenchymateuses pour d’autres applications.

Abstract

La pulpe dentaire humaine représente un réservoir de cellules souches multipotentes prometteur avec une compétence régénérative prééminente qui peut être récoltée à partir d’une dent extraite. L’origine ecto-mésenchymateuse dérivée de la crête neurale des cellules souches de la pulpe dentaire (DPSC) confère un haut degré de plasticité qui doit à ses multiples avantages dans la réparation et la régénération des tissus. Il existe diverses façons pratiques de récolter, de conserver et de faire proliférer les cellules souches adultes à l’étude pour leur utilisation en médecine régénérative. Dans ce travail, nous démontrons l’établissement d’une culture primaire de cellules souches mésenchymateuses à partir de tissu dentaire par la méthode de la culture d’explants. Les cellules isolées étaient en forme de fuseau et adhéraient à la surface en plastique de la plaque de culture. La caractérisation phénotypique de ces cellules souches a montré une expression positive des marqueurs de surface cellulaire recommandés par la société internationale de thérapie cellulaire (ISCT) pour les CSM, tels que CD90, CD73 et CD105. De plus, l’expression négligeable des marqueurs hématopoïétiques (CD45) et endothéliales (CD34), et l’expression inférieure à 2 % des marqueurs HLA-DR, ont confirmé l’homogénéité et la pureté des cultures DPSC. Nous avons également illustré leur multipotence basée sur la différenciation en lignées adipogènes, ostéogéniques et chondrogéniques. Nous avons également induit ces cellules à se différencier en cellules de type hépatique et neuronal en ajoutant des milieux de stimulation correspondants. Ce protocole optimisé aidera à la culture d’une population hautement extensible de cellules souches mésenchymateuses qui seront utilisées en laboratoire ou pour des études précliniques. Des protocoles similaires peuvent être incorporés dans des configurations cliniques pour la pratique de traitements basés sur le DPSC.

Introduction

Les cellules souches adultes sont devenues un outil thérapeutique puissant pour les traitements et les thérapies dirigés contre les cellules en raison de leur plasticité, de leurs mécanismes paracrines et de leurs propriétés immunomodulatrices 1,2,3. Les données encourageantes des études précliniques basées sur les cellules souches ont inspiré les chercheurs à travailler pour la traduction du laboratoire au chevet du patient. Le type de cellules souches utilisé pour la thérapie par cellules souches joue un rôle important dans les résultats positifs. Dans les études précliniques et cliniques, la source la plus largement rapportée de cellules souches mésenchymateuses (CSM) reste la moelle osseuse 4,5. Cependant, les principaux inconvénients de l’utilisation de cellules souches dérivées de la moelle osseuse (BMSC) comprennent leur population rare, des procédures d’isolement très invasives et leur capacité limitée à se développer. Par conséquent, d’autres sources de CSM sont à l’étude. À cet égard, les tissus dentaires, avec leur facilité d’accès, leur énorme plasticité, leur potentiel de régénération élevé et leur grande capacité de prolifération, sont maintenant considérés comme une source alternative riche et potentielle de cellules souches 6,7,8,9,10.

Les cellules souches de la pulpe dentaire (DPSC) ont été le premier type de cellules souches dentaires à être isolé et caractérisé par Gronthos en 200011. Les DPSC ont attiré l’attention pour les applications d’ingénierie tissulaire en raison de leur taux de prolifération élevé, de leur potentiel de différenciation significatif, de leur facilité d’accès avec une culture sans effort et, surtout, de leur capacité à être obtenues à partir d’une dent jetée sans aucun souci éthique12. Les limites posées par d’autres sources de cellules souches, telles que les BMSC et les cellules souches dérivées du tissu adipeux (ADSC), dans leur isolement et leurs capacités d’auto-renouvellement insuffisantes sont contournées par les DPSC13. Les DPSC humaines peuvent être obtenues à partir de dents primaires humaines, de dents permanentes, de dents de sagesse, de dents de lait exfoliées (SHED) et de papilles apicales. De plus, les DPSC peuvent également être isolés à partir de dents surnuméraires, qui sont généralement jetées14. Les DPSC expriment des marqueurs associés à la crête neurale et ont le potentiel de se différencier en cellules neuronales in vitro et in vivo15. En plus de leur potentiel neurogène, les DPSC peuvent se différencier en d’autres lignées cellulaires, telles que ostéogéniques, chondrogéniques, adipogènes, hépatiques et myogènes, lorsqu’elles sont soumises à des conditions de différenciation spécifiques13. Ainsi, ces cellules multipotentes présentent un grand potentiel pour la thérapie cellulaire et peuvent être utilisées pour la régénération de divers tissus. Des études ont également rapporté le rôle potentiel des DPSC dans la reconstruction de la cornée16, la réparation de l’infarctus du myocarde17 et leur rôle thérapeutique potentiel dans des maladies telles que l’ischémie des membres18, la maladie d’Alzheimer 19, la maladie de Parkinson 20 et le vieillissement21. Par conséquent, les cellules souches dérivées du tissu dentaire peuvent être utilisées non seulement pour la régénération dentaire, mais également pour la réparation et la régénération d’organes non dentaires comme les yeux16, les cœurs17, les foies22, les os23 , etc.

Il existe deux méthodes particulières pour isoler une population de CSM à partir du tissu pulpaire : la digestion enzymatique et la culture d’explants24,25. L’établissement réussi de cultures primaires sans aucune différence significative dans la quantité et les propriétés des DPSC a été signalé par ces deux méthodes26. Dans cette étude, nous nous sommes concentrés sur l’isolement des DPSC par la méthode de l’explant27, car cette méthode génère des DPSC sans contamination des cellules hématopoïétiques et endothéliales, par rapport à la digestion enzymatique qui peut entraîner une contamination des fibroblastes28.

Protocol

Toutes les procédures décrites dans l’étude ont été approuvées par le Comité d’éthique de l’Institut (IEC# 9195/PG-12 ITRG/2571-72) de PGIMER, Chandigarh. Toutes les expériences liées à la culture cellulaire doivent être réalisées dans une enceinte de sécurité biologique (BSC) de classe II selon une technique aseptique. La pulpe dentaire a été obtenue à partir de dents saines de trois patients (F/14, M/14 et M/20) subissant des extractions de la troisième molaire pour des raisons orthodontiques….

Representative Results

Ici, nous décrivons comment les chercheurs peuvent établir une culture pure de DPSC via la méthode d’explant 6,7,8,9,10 et les induire vers plusieurs lignées pour établir la pureté de la culture pour des applications en aval. Nous avons établi une culture primaire de DPSC à partir du petit tissu de pulpe extrait d…

Discussion

Les cellules souches ont suscité l’espoir de guérir de nombreuses maladies, en raison de leur plasticité, de leur robustesse, de leurs propriétés immunomodulatrices, de leurs mécanismes paracrines et de leur efficacité de guidage. Le tissu de la pulpe dentaire est considéré comme la source la plus puissante et la plus précieuse de cellules souches, avec une plasticité éminente et une capacité de régénération. Ici, nous démontrons l’isolement des DPSC, en utilisant la méthode de culture d’explants …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous reconnaissons le soutien financier apporté à AK par le Département de la recherche en santé (DHR), ICMR, gouvernement de l’Inde (DHR-NRI Grant # R.12015/01/2022-HR). SR a reçu un financement de l’ICMR, gouvernement de l’Inde (subvention # 2020-7593/SCR-BMS) et PS a reçu une bourse du CSIR, gouvernement de l’Inde. Nous sommes également reconnaissants à Mme Sandhya Tokhi et à Mme Bhupinder Kaur pour leur aide en cytométrie en flux, ainsi qu’à la centrale d’instrumentation sophistiquée (CSIC) et au PGIMER de Chandigarh pour leur soutien infrastructurel.

Materials

6 well cell culture plate Costar 3516 For cell culture
Alcian blue stain EZstain chondrocyte staining kit, HiMedia CCK029
alizarin red S stain Sigma-Aldrich TMS-008 Osteogenic stain
Antibiotic cocktail Himedia A002-5X50ML To prevent culture contamination
Ascorbic Acid Himedia TC094-25G Chondrogenic induction
B27 supplement Gibco 17504044 For neural induction
bFGF ( basic Fibroblast Growth Factor) Gibco PHG0024 For neural induction
CD 105 BD-Pharmingen 560839
CD 35 Biolegend 343604
CD 45 Biolegend 304006
CD 73 Biolegend 344016
CD 90 Biolegend 328107 Characterization
cetyl pyridinium chloride (CPC) Sigma-Aldrich 1104006 For Alizarin Red extraction
Dexamethasone 21-phosphate disodium Sigma-Aldrich D1159-100MG
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Himedia TS1006-5L For washing purpose
EGF (Epidermal Growth Factor) Gibco PHG0311 For hepatic and neural  induction
EVOS LED microscope Invitrogen For  fluorescence imaging
EZ stain Chondrocyte staining kit Himedia CCK029-1KT Chondro stain Kit
FACS Canto flow cytometer BD Biosciences For cell characterization
Fetal Bovine Serum Gibco 16000044 For primary culture
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F2442 For cell culture
G5 supplement Gibco 17503012 For neural induction
HGF( Hepatocyte Growth Factor) Sigma-Aldrich H1404 For hepatic Induction
HLA-DR Biolegend 307605
 Human TGF-β3 Peprotech #100-36E-10U
Insulin-Transferrin-Selenous acid premix Sigma-Aldrich I3146 For hepatic Induction
ITS premix Corning 354350
LDL Uptake Assay kit Abcam ab133127 For hepatic characterization
Low glucose DMEM Gibco 11885-084 For hepatic induction
MAP2 antibody Sigma-Aldrich M4403 For neural characterization
N2 supplement Gibco 17502048 For neural induction
Neural Basal Media Gibco 21103049 For neural induction
NFM antibody Sigma-Aldrich N4142 For neural characterization
Nikon Elipse TS100 microscope Nikon For  fluorescence imaging
Oil Red O Sigma-Aldrich 01391-250Ml Adipogenic stain
Oncostatin M R&D Systems 295-OM-010/CF For hepatic Induction
Petridish Tarson 460090-90MM For tissue cutting
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 15655-100G Osteogenic induction
Propan-2-ol Thermo Fisher Q13827 For Oil Red O extraction
Sodium pyruvate solution Sigma life sciences S8636-100ML
Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich T4049 For cell passaging
Whatman filter paper merck WHA1001325 filter paper
α- Minimum Essential Media (α-MEM) Sigma-Aldrich M0643-10X 1L Media for primary culture
β-glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma-Aldrich G9422-50G

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Kumar, A., Raik, S., Sharma, P., Rattan, V., Bhattacharyya, S. Primary Culture of Dental Pulp Stem Cells. J. Vis. Exp. (195), e65223, doi:10.3791/65223 (2023).

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