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Cancer Research

टीएजीजीजी टेलोमेरे लंबाई परख के प्रदर्शन मापदंडों का अनुकूलन

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/65288
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम गैर-रेडियोधर्मी केमिल्यूमिनेसेंट डिटेक्शन का उपयोग करके टेलोमेयर लंबाई को निर्धारित करने के लिए प्रोटोकॉल का विस्तार से वर्णन करते हैं, जिसमें टीएजीजीजी टेलोमेयर लंबाई परख किट के विभिन्न प्रदर्शन मापदंडों के अनुकूलन पर ध्यान केंद्रित किया जाता है, जैसे कि बफर मात्रा और जांच सांद्रता।

Abstract

टेलोमेरेस दोहराए जाने वाले अनुक्रम हैं जो क्रोमोसोमल सिरों पर मौजूद हैं; उनका छोटा होना मानव दैहिक कोशिकाओं की एक विशिष्ट विशेषता है। अंत प्रतिकृति के साथ एक समस्या और टेलोमेरेज़ एंजाइम की अनुपस्थिति के कारण छोटा होना होता है, जो टेलोमेयर की लंबाई को बनाए रखने के लिए जिम्मेदार है। दिलचस्प बात यह है कि टेलोमेरेस विभिन्न आंतरिक शारीरिक प्रक्रियाओं के जवाब में भी कम हो जाते हैं, जैसे ऑक्सीडेटिव तनाव और सूजन, जो प्रदूषकों, संक्रामक एजेंटों, पोषक तत्वों या विकिरण जैसे बाह्य एजेंटों के कारण प्रभावित हो सकते हैं। इस प्रकार, टेलोमेयर की लंबाई उम्र बढ़ने और विभिन्न शारीरिक स्वास्थ्य मापदंडों के एक उत्कृष्ट बायोमार्कर के रूप में कार्य करती है। टीएजीजीजी टेलोमेयर लंबाई परख किट का उपयोग टेलोमेयर प्रतिबंध खंड (टीआरएफ) परख का उपयोग करके औसत टेलोमेयर लंबाई को मापने के लिए किया जाता है और यह अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है। हालांकि, यह एक महंगी विधि है, और इस वजह से, यह बड़ी नमूना संख्या के लिए नियमित रूप से नियोजित नहीं है। यहां, हम दक्षिणी ब्लॉट्स या टीआरएफ विश्लेषण और गैर-रेडियोधर्मी केमिल्यूमिनेसेंस-आधारित पहचान का उपयोग करके टेलोमेयर लंबाई के अनुकूलित और लागत प्रभावी माप के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।

Introduction

टेलोमेरेस गुणसूत्रों के अंत में मौजूद दोहराए जाने वाले डीएनए अनुक्रम हैं। उनके पास टीटीएजीजीजी के अग्रानुक्रम दोहराव हैं और क्रोमोसोम को फ्रैइंग और अंतिम प्रतिकृति समस्या दोनों से बचाकर जीनोम अखंडता बनाए रखते हैं, जिसका अर्थ है कि 3 'ओवरहैंग का हिस्सा डीएनए पोलीमरेज़ 1,2 द्वारा दोहराया जाने में असमर्थ है। छोटे टेलोमेरेस कोशिकाओं में क्रोमोसोमल असामान्यताएं पैदा करते हैं, जिसके कारण कोशिकाएं प्रतिकृति सेनेसेंस3 नामक एक चरण में स्थायी रूप से गिरफ्तार हो जाती हैं। छोटे टेलोमेरेस अन्य समस्याओं की मेजबानी भी करते हैं, जैसे माइटोकॉन्ड्रिया डिसफंक्शन 4,5 और सेल डिसफंक्शन।

डीएनए टेलोमेरिक दोहराव खो जाता है जब कोशिका विभाजित होती है,प्रति वर्ष 25 से 200 बीपी की औसत हानि के साथ, जिसके परिणामस्वरूप एक निश्चित संख्या में विभाजन6 के बाद सेलुलर शिथिलता होती है। उम्र बढ़ने को कोमोर्बिडिटी की उच्च आवृत्ति के साथ जोड़ा जाता है, जिसे टेलोमेयर लंबाई7 में कमी द्वारा चिह्नित किया जाता है। टेलोमेयर प्रतिबंध टुकड़ा (टीआरएफ) विश्लेषण, जैसा कि मेंडर द्वारा वर्णित है, एक बहुत ही महंगी विधिहै। इस वजह से, अधिकांश अध्ययनों में टेलोमेयर की लंबाई को निर्धारित करते समय इसे लागू नहीं किया जाता है।

वर्तमान में, महामारी विज्ञान के अधिकांश अध्ययन टेलोमेयर लंबाई के मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (क्यूपीसीआर) -आधारित माप को नियोजित करते हैं। हालांकि, क्यूपीसीआर-आधारित विधि एक सापेक्ष माप विधि है, क्योंकि यह टेलोमेरेस और एकल-प्रतिलिपि जीन प्रवर्धन उत्पादों के बीच अनुपात को मापता है, न कि पूर्ण टेलोमेयर लंबाई। टीआरएफ प्रोटोकॉल का उपयोग करके टेलोमेयर लंबाई माप सोने की मानक विधि है, क्योंकि यह नमूने में टेलोमेयर लंबाई वितरण को माप सकता है और माप को किलोबेस (केबी) में पूर्ण मूल्यों में व्यक्त किया जा सकता है। हालांकि, इसका उपयोग सीमित है क्योंकि यह बोझिल, श्रम-गहन और महंगा है। यहां, हम केमिल्यूमिनेसेंस-आधारित टीआरएफ का उपयोग करके टेलोमेयर लंबाई माप के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

टीआरएफ विश्लेषण में सात प्रमुख चरण शामिल हैं: 1) जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण के लिए कोशिकाओं का संवर्धन, 2) फिनोल का उपयोग करके जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण: क्लोरोफॉर्म: आइसोमिलअल्कोहल (पी: सी: आई) विधि, 3) जीनोमिक डीएनए का प्रतिबंध पाचन, 4) एगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन, 5) प्रतिबंध पाचन डीएनए टुकड़े का दक्षिणी सोख्ता, 6) संकरण और पता लगाने के माध्यम से केमिल्यूमिनेसेंस- स्थिर टेलोमेयर जांच को क्षारीय फॉस्फेट के लिए एक अत्यधिक संवेदनशील केमिलिमिनसेंट सब्सट्रेट द्वारा देखा जाता है, डाइसोडियम 2-क्लोरो-5-(4-मेथॉक्सीस्पाइरो[1,2-डायोक्सेटेन-3,2'-(5-क्लोरोट्राइसाइक्लो[3.3.1.13.7]डेकान)-4-वाईएल]-1-फिनाइल फॉस्फेट (सीडीपी-स्टार)-और 7) विश्लेषण इन टेलोमेरिक स्मीयर से औसत टेलोमेयर लंबाई और रेंज जानकारी प्राप्त करने के लिए।

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Protocol

नोट: नीचे प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले सभी अभिकर्मकों के बारे में विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें। तालिका 1 में अनुकूलित मात्रा के साथ प्रयोगशाला-निर्मित अभिकर्मकों को सूचीबद्ध किया गया है और तालिका 2 व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मकों की कामकाजी सांद्रता को दर्शाती है।

1. सेल संस्कृति

  1. डलबेकको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) में उन कोशिकाओं को बनाए रखें जिनके टेलोमेयर की लंबाई को मापा जाना है (यहां उपयोग की जाने वाली ए 2780 कोशिकाएं थीं, जो एक डिम्बग्रंथि एडेनोकार्सिनोमा सेल लाइन है) पूर्ण माध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), स्ट्रेप्टोमाइसिन, पेनिसिलिन और एम्फोटेरिसिन बी के साथ पूरक 6 सेमी पेट्री डिश में। 5% कार्बन डाइऑक्साइड युक्त ह्यूमिडिफायर और नियंत्रित वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें जब तक कि कोशिकाएं 80% -100% कंफ्लुएंट न हों।
  2. मीडिया को निकालें और 1x फॉस्फेट-बफर्ड सलाइन (पीबीएस) के 5 मिलीलीटर से धो लें।
  3. 3-5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इंजेक्शन लगाकर कोशिकाओं को अलग करने के लिए ट्रिप्सिन-एथिलीनडायमाइनटेट्राएसेटिक एसिड (ईडीटीए) के 1 एमएल के साथ कोशिकाओं का इलाज करें।
  4. ट्रिप्सिन को निष्क्रिय करने और सेंट्रीफ्यूजेशन ट्यूब में कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए डीएमईएम पूर्ण मीडिया के 2 एमएल जोड़ें।
  5. 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को 2,348 × ग्राम पर गोली दें।
  6. 1x PBS और सेंट्रीफ्यूज से 5 मिनट के लिए 2,348 × g पर गोली धो लें।
  7. गोली को -80 डिग्री सेल्सियस पर आगे के उपयोग तक स्टोर करें।
    नोट: सेल लाइन के आधार पर सेल गिनती भिन्न हो सकती है। हमने ए 2780 सेल लाइन के मामले में लगभग 2.5 × 106 कोशिकाएं प्राप्त कीं, जिसका उपयोग आगे के चरणों में किया जाता है।

2. जीनोमिक डीएनए अलगाव

  1. सेल गोली में 500 μL लाइसिस बफर (10 mM tris-Cl, pH 8.0; 25 mM EDTA, pH 8.0; 100 mM NaCl; 0.5% w/v सोडियम डोडेसिल सल्फेट) जोड़ें और धीरे से एक कट टिप (न्यूनतम 2 मिमी के उद्घाटन व्यास के साथ) का उपयोग करके मिलाएं। 20 μg/mL ताजा तैयार RNase A जोड़ें और व्युत्क्रम द्वारा धीरे से मिलाएं।
  2. 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें और कभी-कभी इनक्यूबेशन के दौरान ट्यूब को इनवर्ट करें।
  3. 100 μg /mL की अंतिम सांद्रता में प्रोटीन K जोड़ें और 10 बार व्युत्क्रम द्वारा धीरे से मिलाएं। 2 घंटे के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के दौरान नियमित अंतराल (हर 10 मिनट) पर ट्यूब को इनवर्ट करें।
  4. फिनोल के 500 μL जोड़ें: क्लोरोफॉर्म: आइसोमिल अल्कोहल अभिकर्मक (25: 24: 1) और 20 बार व्युत्क्रम द्वारा धीरे से मिलाएं। कमरे के तापमान (लगभग 25 डिग्री सेल्सियस) पर 15 मिनट के लिए 9,391 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज।
    नोट: चित्रा 1 ए सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद प्राप्त तीन परतों को दर्शाता है।
  5. दिखाई देने वाली तीन परतों में से चिपचिपी ऊपरी जलीय परत को हटा दें, कट टिप का उपयोग करके एक ताजा ट्यूब में रखें, और क्लोरोफॉर्म की समान मात्रा जोड़ें। 20 बार सौम्य व्युत्क्रम द्वारा मिलाएं।
  6. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए ट्यूबों को 9,391 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  7. जलीय परत को इकट्ठा करें और 5 M NaCl की उचित मात्रा जोड़ें ताकि NaCl की अंतिम एकाग्रता 0.2 M हो।
  8. 100% इथेनॉल के दो वॉल्यूम जोड़ें। 20-25 बार सौम्य व्युत्क्रम द्वारा मिलाएं। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 15,871 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज।
  9. सतह पर तैरनेवाला निकालें और गोली को धोने के लिए 70% इथेनॉल के 500 μL जोड़ें। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 15,871 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज।
  10. सतह पर तैरने वाला को हटा दें, गोली को कुछ मिनटों के लिए हवा में सुखाएं, और बाँझ न्यूक्लियस-मुक्त पानी के 50 μL जोड़ें। कमरे के तापमान पर डीएनए को 1-2 दिनों के लिए फिर से हाइड्रेट करने दें। कट टिप का उपयोग करके, पाइपिंग करके मिलाएं।
  11. पराबैंगनी (यूवी) -स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री का उपयोग करके डीएनए की एकाग्रता को मापें। यदि आवश्यक हो, तो 300-500 एनजी / μL की न्यूनतम सांद्रता प्राप्त करने के लिए बाँझ न्यूक्लियस-मुक्त पानी का उपयोग करके नमूनों को फिर से पतला करें।
  12. इसे 1% एगारोस जेल (चित्रा 1 बी) पर चलाकर डीएनए की अखंडता की जांच करें।
  13. आगे के उपयोग तक -20 डिग्री सेल्सियस पर पतला डीएनए स्टोर करें।

3. जीनोमिक डीएनए का पाचन

  1. Rsa1 (20 U) और Hinf1 (20 U) का एक एंजाइम मिश्रण तैयार करें और प्रति प्रतिक्रिया प्रतिबंध पाचन बफर के 2 μL जोड़ें।
  2. जीनोमिक डीएनए की एक उपयुक्त मात्रा लें जैसे कि डीएनए की कुल मात्रा 1.5 μg है। बाँझ न्यूक्लियस-मुक्त पानी के साथ मात्रा बनाएं, ताकि एंजाइम जोड़ने के बाद कुल मात्रा 20 μL हो।
  3. टैप करके अच्छी तरह मिलाएं, इसके बाद पल्स स्पिन करें।
  4. मिश्रण को 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।

4. अगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन

  1. उच्च श्रेणी के अगारोस का उपयोग करके 1x tris एसीटेट EDTA (TAE) बफर में 10 सेमी × 15 सेमी 0.8% एगारोस जेल तैयार करें।
  2. प्रत्येक पचने वाले जीनोमिक डीएनए नमूने में लोडिंग डाई के 5 μL जोड़ें, इस प्रकार अंतिम मात्रा 25 μL बनाते हैं, और नमूने को जेल पर लोड करते हैं।
  3. आणविक मार्कर (सीढ़ी) के 1 μL, बाँझ न्यूक्लियस-मुक्त पानी के 3 μL, और 5x लोडिंग डाई के 1 μL का उपयोग करके एक आणविक मार्कर मिश्रण तैयार करें।
  4. जीनोमिक डीएनए पचने वाले नमूनों के दोनों किनारों पर आणविक मार्कर मिश्रण के 5 μL लोड करें यदि नमूनों की संख्या अधिक है (~ 10), या केवल एक तरफ यदि पांच नमूनों से कम या बराबर हैं।
  5. जेल को 6 घंटे के लिए 5 V/cm पर चलाएं। एक बार रन पूरा हो जाने के बाद, लोडिंग ऑर्डर को चिह्नित करने के लिए जेल के एक कोने पर एक नॉच बनाएं।
  6. जेल को 0.25 एम एचसीएल में कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए कोमल आंदोलन के साथ डुबोएं।
  7. आसुत जल के साथ जेल को दो बार धो लें।
  8. जेल को 0.5 M NaOH और 1.5 M NaCl के घोल में 15 मिनट के लिए दो बार 15 मिनट के लिए कोमल आंदोलन के साथ डुबोकर डीएनए को विकृत करें।
  9. आसुत जल के साथ जेल को दो बार धो लें।
  10. जेल को 0.5 एम ट्रिस-एचसीएल और 3 एम एनएसीएल (पीएच 7.5) के घोल में 15 मिनट के लिए दो बार कोमल आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर डुबोकर डीएनए को बेअसर करें।

5. दक्षिणी सोख्ता

  1. 10 सेमी × 12 सेमी आकार की नायलॉन झिल्ली काटें और जेल के समान स्थिति में एक पायदान बनाएं।
  2. आसुत जल में डुबोकर झिल्ली को सक्रिय करें, इसके बाद 20x सोडियम सलाइन साइट्रेट (एसएससी) बफर ( तालिका 1 देखें)।
  3. स्थानांतरण सेट करें.
    1. एक साफ ग्लास ट्रे लें और उसमें एक और ट्रे को उल्टी स्थिति में रखें। नियमित फिल्टर पेपर का उपयोग करके एक बाती बनाएं जैसे कि छोर बाहरी ट्रे के आधार को छू रहे हैं।
    2. जेल को फिल्टर पेपर के ऊपर रखें। धीरे से सक्रिय नायलॉन झिल्ली को जेल के ऊपर रखें, जिसमें डिग्री अतिव्यापी हो, और कांच की छड़ पर लुढ़ककर किसी भी हवा के बुलबुले को हटा दें।
    3. 9.5 सेमी × 11.5 सेमी सेल्यूलोज फिल्टर पेपर का 2 सेमी ढेर रखें, इसके बाद समान आयामों के नियमित फिल्टर पेपर का 6 सेमी ढेर रखें। इस सेटअप के ऊपर एक वजन रखें ताकि नीचे समान वजन वितरण हो। बाहरी ट्रे को 20x SSC बफर से भरें ( चित्र 2 देखें)।
    4. रात भर स्थानांतरण के लिए सेटअप छोड़ दें।
  4. दक्षिणी स्थानांतरण के बाद, यूवी ट्रांसलुमिनेटर या यूवी क्रॉसलिंकर पर यूवी क्रॉसलिंकिंग द्वारा झिल्ली पर स्थानांतरित डीएनए को ठीक करें। 5 मिनट के लिए 302 एनएम 8 डब्ल्यू लैंप, या 2 मिनट के लिए 254 एनएम 8 डब्ल्यू लैंप का उपयोग करें, जो लगभग 120 एमजे से मेल खाती है। सुनिश्चित करें कि झिल्ली पक्ष जिस पर डीएनए स्थानांतरित किया जाता है, दीपक का सामना करता है।
  5. 2x एसएससी बफर के 25 मिलीलीटर के साथ झिल्ली को दो बार धोएं।
  6. यदि आवश्यक हो, तो ब्लॉट को पूरी तरह से सुखाकर प्रोटोकॉल को रोकें और इसे पन्नी में ढीले से लपेटने के बाद 2-8 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, आगे की प्रक्रिया तक।

6. हाइब्रिडाइजेशन और केमिल्यूमिनेसेंस डिटेक्शन।

  1. प्रीहाइब्रिडाइजेशन बफर को 42 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
    नोट: निम्नलिखित चरणों में प्रति 100 सेमी2 ब्लॉट में उपयोग किए जाने वाले समाधान / बफर की मात्रा शामिल है।
  2. प्रीहाइब्रिडाइजेशन के लिए कोमल आंदोलन के साथ 42 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 10 एमएल प्रीहाइब्रिडाइजेशन बफर में झिल्ली को इनक्यूबेट करें।
  3. संकरण समाधान बनाने के लिए प्रीवार्म्ड प्रीहाइब्रिडाइजेशन बफर के प्रति 5 एमएल टेलोमेयर जांच के 0.5 μL जोड़ें।
  4. कोमल आंदोलन के साथ 3 घंटे के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर संकरण घोल के 10 मिलीलीटर में धब्बे को इनक्यूबेट करें।
  5. कोमल आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर 10 मिनट (प्रत्येक 25 मिलीलीटर) के लिए कड़े बफर 1 (तालिका 1) के साथ धब्बे को दो बार धोएं।
  6. 50 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए कड़े बफर 2 (तालिका 1) को गर्म करें।
  7. 50 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट (प्रत्येक 25 मिलीलीटर) के लिए कड़े बफर 2 के साथ धब्बे को दो बार हल्के आंदोलन के साथ धोएं।
  8. आरटी पर नरम आंदोलन के साथ 5 मिनट के लिए 15 मिलीलीटर वॉश बफर के साथ कुल्ला करें।
  9. कोमल आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए ताजा तैयार 1x ब्लॉकिंग घोल के 10 मिलीलीटर में झिल्ली को इनक्यूबेट करें।
  10. झिल्ली को 10 मिलीलीटर एंटी-डिजियोक्सीजेनिन में क्षारीय फॉस्फेट वर्किंग सॉल्यूशन ( तालिका 2 देखें) के साथ संयुग्मित 30 मिनट के लिए आरटी पर कोमल आंदोलन के साथ इनक्यूबेट करें।
  11. धब्बे को 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर वॉश बफर के साथ दो बार धोएं।
  12. कोमल आंदोलन के साथ आरटी पर 5 मिनट के लिए 10 मिलीलीटर डिटेक्शन बफर में इनक्यूबेट करें।
  13. अतिरिक्त पहचान बफर को हटा दें और डीएनए के साथ झिल्ली को संकरण बैग या एसीटेट शीट पर ऊपर की ओर रखें। झिल्ली पर ~ 1-1.5 एमएल सब्सट्रेट समाधान ड्रॉपवाइज जोड़ें, तुरंत उस पर एक और शीट रखें, और आरटी पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  14. इमेजिंग के लिए अतिरिक्त सब्सट्रेट समाधान को निचोड़ें।
  15. एक जेल प्रलेखन इमेजिंग सिस्टम में लगभग 20 मिनट के लिए धब्बा की छवि बनाएं, विभिन्न समय बिंदुओं पर कई छवियों को एकत्र करें। आगे के विश्लेषण के लिए असंतृप्त छवियों का चयन करें।
    नोट: यदि सिग्नल कमजोर है, तो इमेजिंग को लंबे समय तक किया जा सकता है।

7. विश्लेषण

  1. छवि फ़ाइलों को प्राप्त करने के बाद, उन्हें संभव उच्चतम रिज़ॉल्यूशन (इस मामले में 600 डीपीआई) पर .tif प्रारूप में प्रकाशन के लिए निर्यात करें।
  2. टेलोटूल सॉफ्टवेयर स्थापित करें। इसे चलाने के लिए MATLAB (स्वतंत्र रूप से उपलब्ध) के एक विशिष्ट संस्करण (R2012a) की आवश्यकता होती है।
  3. सॉफ़्टवेयर खोलें और शीर्ष दाईं ओर लोड छवि फ़ाइल बटन पर क्लिक करें।
  4. छवि लोड होने के बाद, इनवर्ट छवि पर क्लिक करें, ताकि छवि पृष्ठभूमि काली हो और स्मीयर / बैंड सफेद हों।
  5. कुओं से शुरू होने वाले शीर्ष कोनों के साथ छवि को क्रॉप करें। फसल चयन हो जाने के बाद, इसके अंदर राइट-क्लिक करें और क्रॉप इमेज का चयन करें।
  6. छवि क्रॉप होने के बाद, लेन की गणना पर क्लिक करें और लेन डिटेक्शन को स्वचालित रूप से होने दें।
  7. यदि लेन का ठीक से पता नहीं लगाया गया है, उदाहरण के लिए, यदि कुछ लेन का पता नहीं लगाया गया है, या यदि अतिरिक्त या आंशिक लेन का पता लगाया गया है, तो नीचे वर्णित के रूप में लेन समायोजन करें।
    1. लेन समायोजित करें पर क्लिक करें और खुलने वाली पॉप-अप विंडो में, आवश्यकतानुसार लेन जोड़ें और / या समायोजित करें, और लागू करें और बंद करें पर क्लिक करें
  8. लेन को समायोजित करने के बाद, सुनिश्चित करें कि प्रत्येक लेन पर एक लाल बिंदु देखा जाता है और लैडर फिट बटन का उपयोग करके सीढ़ी को समायोजित करें, यह सुनिश्चित करें कि दोनों सीढ़ी लेन में चोटियों की संख्या एक ही स्थिति में है। डिलीट एक्सट्रीमम बटन का उपयोग करके किसी भी बाहरी चोटियों को हटा दें।
  9. सीढ़ी समायोजित होने के बाद, लेन प्रोफाइल का चयन करें, लैडर फिट पर क्लिक करें, और बहुपद फिट का चयन करें।
  10. सॉफ़्टवेयर द्वारा अनुशंसित ट्रेंडलाइन पर क्लिक करें, और फिर अगले विकल्प में सही का चयन करें।
  11. परिणामों को तालिका के रूप में प्रदर्शित करने के लिए परिणाम प्राप्त करें पर क्लिक करें, जिसमें औसत टीआरएफ पंक्ति संबंधित लेन नमूनों का टेलोमेयर लंबाई माप है।
  12. स्प्रेडशीट के रूप में परिणामों को संग्रहीत करने के लिए सभी सहेजें पर क्लिक करें।

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Representative Results

निकाले गए जीनोमिक डीएनए (जीडीएनए), जिसे 1% एगारोस जेल पर चलाया गया था, ने अच्छी अखंडता दिखाई, जैसा कि चित्रा 1 बी में दिखाया गया है, यह दर्शाता है कि नमूने का उपयोग टीआरएफ के आगे डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण के लिए किया जा सकता है। टीआरएफ परख तब प्रत्येक चरण में आवश्यक समाधानों की मात्रा को संशोधित करके किया गया था (तालिका 1 और तालिका 2 देखें)। टीआरएफ सिग्नल स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहा था (चित्रा 3)। इस प्रकार, समाधान की मात्रा और सांद्रता को संशोधित करके, परिणामों पर किसी भी नकारात्मक प्रभाव के बिना अधिक नमूने संसाधित किए जा सकते हैं, और टेलोटूल10 जैसे स्वतंत्र रूप से उपलब्ध सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके टेलोमेयर की लंबाई सफलतापूर्वक निर्धारित की जा सकती है।

Figure 1
चित्रा 1: जीनोमिक डीएनए का अलगाव और गुणवत्ता की जांच। () फिनोल जोड़ने के बाद सेंट्रीफ्यूजेशन पर प्राप्त तीन अलग-अलग पृथक्करण चरण: क्लोरोफॉर्म: आइसोमिल अल्कोहल। ऊपरी जलीय परत में जीडीएनए होता है, इंटरफेज़ में प्रोटीन होता है, और निचले, कार्बनिक चरण में अवक्रमित आरएनए, सेल मलबे और लिपिड होते हैं। (बी) 1% एगरोज जेल की एक छवि जो बरकरार बिना पचे हुए जीडीएनए को दिखाती है। लेन 1 एक 1 केबी सीढ़ी दिखाता है और लेन 2 कैंसर सेल लाइन ए 2780 के अनपचे हुए जीडीएनए को दर्शाता है। संक्षिप्त नाम: जीडीएनए = जीनोमिक डीएनए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: दक्षिणी सोख्ता हस्तांतरण सेटअप का चित्रण। केशिका क्रिया द्वारा जेल से नायलॉन झिल्ली में टेलोमेयर रिपीट स्मीयर के स्थानांतरण के लिए सिस्टम असेंबली को दर्शाने वाला प्रतिनिधि आरेख। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: दक्षिणी सोख्ता और संकरण के बाद टीआरएफ का केमिल्यूमिनेसेंस का पता लगाना। लेन 2 में स्मीयर के रूप में टेलोमेरिक दोहराव की एक श्रृंखला दिखाने वाला धब्बा। लेन 1 एक आणविक मार्कर दिखाता है, जिसमें बाईं ओर इंगित बैंड के आणविक भार (केबी) होते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले अभिकर्मकों की सूची। तालिका में प्रयोगशाला में तैयार अभिकर्मकों के साथ उनके भंडारण विवरण, टीएजीजीजी टेलोमेयर लंबाई परख किट अभिकर्मकों के अनुशंसित उपयोग और इस प्रोटोकॉल में अनुकूलन के अनुसार उनके संशोधित उपयोग की मात्रा शामिल है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 2: संशोधित उपयोग निर्देशों के साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मकों की सूची। तालिका में इस प्रोटोकॉल में अनुकूलन के अनुसार, विभिन्न कमजोर पड़ने, उनके भंडारण विवरण, और टीएजीजीजी टेलोमेयर लंबाई परख किट और संशोधित उपयोग मात्रा द्वारा उनके अनुशंसित उपयोग के साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मक शामिल हैं। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

हम दक्षिणी सोख्ता का उपयोग करके टेलोमेयर लंबाई माप के लिए एक गैर-रेडियोधर्मी, केमिल्यूमिनेसेंस-आधारित विधि के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया का वर्णन करते हैं। प्रोटोकॉल का परीक्षण कई अभिकर्मकों के विवेकपूर्ण उपयोग की अनुमति देने के लिए किया गया है, जिसमें परिणामों की गुणवत्ता पर कोई समझौता नहीं किया गया है। प्रीहाइब्रिडाइजेशन और हाइब्रिडाइजेशन बफर को पांच बार तक पुन: उपयोग किया जा सकता है। परिणामों को प्रभावित किए बिना एंजाइम एकाग्रता जीनोमिक डीएनए के 10-20 यू प्रति 1.5-2 μg के बीच भिन्न हो सकती है। कई अन्य किट घटक, जैसे कि डीआईजी-लेबल आणविक भार मार्कर और संकरण जांच, अनुशंसित से कम सांद्रता पर उपयोग किया जा सकता है। अनुकूलित वॉल्यूम तालिका 2 में दर्शाए गए हैं। हमने उन्हें अनुशंसित मात्रा / सांद्रता के आधे पर परीक्षण किया है और इष्टतम प्रदर्शन पाया है। इन चरणों का पालन करने से प्रति नमूना लागत काफी कम हो जाती है, इस प्रकार शोधकर्ताओं को बड़े पैमाने पर इस विधि का उपयोग करके टेलोमेयर की लंबाई को मापने में सक्षम बनाता है।

कई प्रकाशित टीआरएफ प्रोटोकॉल हैं। हमने व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट प्रोटोकॉल को लागत प्रभावी बनाने के लिए अनुकूलित किया है। यह प्रोटोकॉल कुछ प्रकाशित प्रोटोकॉल से अलग है क्योंकि यह रेडियोधर्मिता11,12 का उपयोग नहीं करता है। यह अपेक्षाकृत सरल भी है, क्योंकि यह इन-हाउस अभिकर्मकों को तैयार करने के बजाय किट घटकों का उपयोग करता है, विशेष रूप से टेलोमेयर जांच13

यदि अंतिम छवि पैची है, तो इनक्यूबेशन के दौरान झिल्ली आंशिक रूप से सूख गई है। इसे हल करने के लिए, किसी को या तो समाधान की मात्रा बढ़ानी चाहिए या उच्च गति से आंदोलन करना चाहिए। यदि धब्बा पर कोई धब्बा दिखाई नहीं दे रहा है, तो दक्षिणी स्थानांतरण के दौरान एक समस्या हो सकती है। इसके अलावा, डीएनए की मात्रा या गुणवत्ता में कोई समस्या हो सकती है।

इस विधि की कुछ सीमाएँ हैं। सबसे पहले, जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण और परिमाणीकरण डीएनए14 के स्रोत के आधार पर 4 दिनों से ऊपर की ओर जाता है। उच्च आणविक भार डीएनए को पुनर्जलीकरण और समरूप करने में अधिक समय लगता है, जिससे मात्रा और सटीक पाइपिंग मुश्किल हो जाती है। दूसरा, टीआरएफ प्रोटोकॉल लंबा (2 दिन न्यूनतम) है और इसे लागू करने के लिए कुशल प्रयोगशाला श्रमिकों की आवश्यकता होती है। अभिकर्मकों और आवश्यक मात्रा के कारण यह एक महंगी विधि भी है। टीआरएफ प्रोटोकॉल प्रत्येक नमूने में औसत टेलोमेयर की लंबाई को भी मापता है, जो टेस्ला की सबसे छोटी टेलोमेयर लंबाई या प्रति सेल टेलोमेयर लंबाई के विपरीत है जो फ्लो साइटोमेट्री-आधारित विधियांप्रदान करती हैं। यहां उपयोग किए जाने वाले एंजाइमों का उपयोग करके टीआरएफ विश्लेषण की एक और सीमा टेलोमेयर की लंबाई की अतिवृद्धि है, क्योंकि इन एंजाइमों में उप-टेलोमेरिकक्षेत्रों में प्रतिबंध स्थल नहीं है।

हालांकि, सीमाओं के बावजूद, ऐसे कारण हैं कि इस विधि को अभी भी टेलोमेयर लंबाई माप का स्वर्ण मानक माना जाता है। टेलोमेयर लंबाई को पूर्ण मूल्यों में सटीक रूप से प्रस्तुत किया जाता है-किलोबेस जोड़े (केबीपी) में।

इस विधि का उपयोग विभिन्न प्रकार के सेल प्रकारों में औसत टेलोमेयर की लंबाई को मापने के लिए किया जा सकता है, सेल लाइनों 16,17 से बफी कोट छर्रों 18,19 तक। यह इसे कई प्रकार के शोध अध्ययनों में उपयोग करने के लिए एक मजबूत तरीका बनाता है। इसका उपयोग बड़े पैमाने पर महामारी विज्ञान के अध्ययन के साथ-साथ उन अध्ययनों में भी किया जा सकता है जहां सेल-आधारित चिकित्सीय विकसित किए जा रहे हैं।

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Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम प्रोटोकॉल अनुकूलन के साथ शुरू में हमारी मदद करने के लिए सुश्री प्राची शाह को धन्यवाद देना चाहते हैं। हम ए 2780 डिम्बग्रंथि के कैंसर सेल लाइन प्रदान करने के लिए डॉ मनोज गर्ग को धन्यवाद देना चाहते हैं। ईके को जैव प्रौद्योगिकी विभाग (संख्या बीटी/आरएलएफ/री-एंट्री/06/2015), विज्ञान और प्रौद्योगिकी विभाग (ईसीआर/2018/002117), और एनएमआईएमएस बीज अनुदान (आईओ 401405) से अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Line
A2780 (Ovarian adenocarcinoma cell line) Received as a gift
Equipment
ChemiDoc XRS+ (for imaging and UV cross linking) Biorad Universal hood II (721BR14277)
Nanodrop (Epoch 2) Biotek EPOCH2
Software
TeloTool Version 1.3
Materials
Acetic Acid Molychem 64-19-7
Agarose MP 180720
Amphotericin B Gibco, ThermoFisher Scientific, USA 15240062
DMEM  HyClone, Cytiva, USA SH30243.01
Ethylenediamine tetraacetic acid  Molychem 6381-92-6
HI FBS Gibco, ThermoFisher Scientific, USA 10270106
HCl Molychem 76-47-01-0
NaCl Molychem 7647-14-5
NaOH Molychem 1310-73-2
Nylon membrane Sigma 11209299001
Penicillin Gibco, ThermoFisher Scientific, USA 15240062
Sodium dodecyl sulfate Affymetrix 151-21-3
Streptomycin Gibco, ThermoFisher Scientific, USA 15240062
Tris BIORAD 77-86-1
Tris HCl Sigma Aldrich 1185-53-1
Whatman paper GE healthcare lifesciences 1001-917
Reagents
1 kb ladder NEB N3232S
20x SSC Invitrogen 15557-036
Anti DIG AP Telo TAGGG Telomere Length Assay kit 12209136001
Blocking solution 10x Telo TAGGG Telomere Length Assay kit 12209136001
Cutsmart Buffer NEB B6004
Detection buffer 10x Telo TAGGG Telomere Length Assay kit 12209136001
Dig easy hyb Telo TAGGG Telomere Length Assay kit 12209136001
Digestion Buffer Telo TAGGG Telomere Length Assay kit 12209136001
Hinf 1 Telo TAGGG Telomere Length Assay kit 12209136001
Hinf 1 (alternative to kit) NEB R0155T
Loading Dye BIOLABS N3231S
Maleic acid buffer 10x Telo TAGGG Telomere Length Assay kit 12209136001
Molecular marker Telo TAGGG Telomere Length Assay kit 12209136001
Probe Telo TAGGG Telomere Length Assay kit 12209136001
Rsa 1 Telo TAGGG Telomere Length Assay kit 12209136001
Rsa 1 (alternative to kit) NEB R0167L
Substrate Telo TAGGG Telomere Length Assay kit 12209136001
Wash buffer Telo TAGGG Telomere Length Assay kit 12209136001

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References

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इस महीने JoVE में अंक 194
टीएजीजीजी टेलोमेरे लंबाई परख के प्रदर्शन मापदंडों का अनुकूलन
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Jain, M., Madeka, S., Khattar, E.More

Jain, M., Madeka, S., Khattar, E. Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay. J. Vis. Exp. (194), e65288, doi:10.3791/65288 (2023).

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