Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Optimalisering av ytelsesparametere for TAGGG-telomerlengdeanalysen

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/65288
* These authors contributed equally

Summary

Her beskriver vi i detalj protokollen for kvantifisering av telomerlengde ved bruk av ikke-radioaktiv kjemiluminescerende deteksjon, med fokus på optimalisering av ulike ytelsesparametere for TAGGG-telomerlengdeanalysesettet, for eksempel buffermengder og sondekonsentrasjoner.

Abstract

Telomerer er repeterende sekvenser som er tilstede ved kromosomale ender; Deres forkortelse er et karakteristisk trekk ved menneskelige somatiske celler. Forkortelse oppstår på grunn av et problem med sluttreplikasjon og fraværet av telomerase-enzymet, som er ansvarlig for å opprettholde telomerlengden. Interessant nok forkortes telomerer også som respons på ulike interne fysiologiske prosesser, som oksidativt stress og betennelse, som kan påvirkes på grunn av ekstracellulære midler som forurensninger, smittsomme stoffer, næringsstoffer eller stråling. Dermed tjener telomerlengden som en utmerket biomarkør for aldring og ulike fysiologiske helseparametere. TAGGG telomerlengdeanalysesett brukes til å kvantifisere gjennomsnittlige telomerlengder ved bruk av telomerrestriksjonsfragmentet (TRF) analysen og er svært reproduserbar. Det er imidlertid en kostbar metode, og på grunn av dette brukes den ikke rutinemessig for store utvalgsnumre. Her beskriver vi en detaljert protokoll for en optimalisert og kostnadseffektiv måling av telomerlengde ved hjelp av Southern blots eller TRF-analyse og ikke-radioaktiv kjemiluminescensbasert deteksjon.

Introduction

Telomerer er de repeterende DNA-sekvensene som er tilstede på slutten av kromosomene. De har tandemrepetisjoner av TTAGGG og opprettholder genomintegritet ved å beskytte kromosomet mot både frynsing og sluttreplikasjonsproblemet, noe som betyr at en del av 3'-overhenget ikke kan replikeres av DNA-polymerase 1,2. Korte telomerer fører til kromosomale abnormiteter i celler, på grunn av hvilke celler blir permanent arrestert i et stadium som kalles replikativ senescens3. Korte telomerer forårsaker også en rekke andre problemer, som mitokondrier dysfunksjon 4,5 og celledysfunksjon.

DNA-telomerrepetisjoner går tapt når cellen deler seg, med et gjennomsnittlig tap på 25 til 200 bp per år 6, noe som resulterer i cellulær senescens etter et visst antall divisjoner6. Aldring er forbundet med en høyere frekvens av komorbiditeter, som er preget av en forkortelse i telomerlengde7. Telomere restriksjonsfragment (TRF) analyse, som beskrevet av Mender, er en svært kostbar metode8. På grunn av dette er det ikke implementert mens man kvantifiserer telomerlengde i de fleste studier.

For tiden benytter flertallet av epidemiologiske studier kvantitative polymerasekjedereaksjoner (qPCR)-baserte målinger av telomerlengde. Den qPCR-baserte metoden er imidlertid en relativ målemetode, da den måler forholdet mellom telomerer og enkeltkopi-genamplifikasjonsprodukter, og ikke absolutt telomerlengde. Telomerlengdemåling med TRF-protokollen er gullstandardmetoden, da den kan måle telomerlengdefordelingen i prøven og målingene kan uttrykkes i absolutte verdier i kilobaser (kb). Imidlertid er bruken begrenset fordi den er tungvint, arbeidsintensiv og kostbar. Her presenterer vi en optimalisert protokoll for måling av telomerlengde ved bruk av kjemiluminescensbaserte TRFer.

TRF-analyse inkluderer syv hovedtrinn: 1) dyrking av celler for genomisk DNA-ekstraksjon, 2) genomisk DNA-ekstraksjon ved hjelp av fenol: kloroform: isoamylalkohol (P: C: I) -metoden, 3) restriksjonsfordøyelse av genomisk DNA, 4) agarosegelelektroforese, 5) Sørlig blotting av restriksjonsfordøyelsens DNA-fragment, 6) hybridisering og deteksjon via Kjemiluminescens-Den immobiliserte telomersonden visualiseres ved et svært følsomt kjemiluminescerende substrat for alkalisk fosfatase, dinatrium 2-klor-5-(4-metoksyspiro[1,2-dioksetan-3,2'-(5-klorotrisyklo[3.3.1.13.7]dekan])-4-yl]-1-fenylfosfat (CDP-Star)-og 7) analyse for å oppnå gjennomsnittlig telomerlengde og rekkeviddeinformasjon fra disse telomeriske utstrykene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: Se materialfortegnelsen for detaljer om alle reagenser som brukes i protokollen nedenfor. Tabell 1 viser laboratoriefremstilte reagenser sammen med optimaliserte volumer, og tabell 2 viser arbeidskonsentrasjoner av kommersielt tilgjengelige reagenser.

1. Cellekultur

  1. Vedlikehold celler hvis telomerlengde skal måles (brukt her var A2780-celler, som er en ovarieadenokarsinomcellelinje) i Dulbeccos modifiserte ørnemedium (DMEM) komplett medium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), streptomycin, penicillin og amfotericin B i en 6 cm petriskål. Inkuber ved 37 °C i et fuktet og kontrollert miljø som inneholder 5 % karbondioksid til cellene er 80 % -100 % sammenflytende.
  2. Fjern mediet og vask med 5 ml 1x fosfatbufret saltvann (PBS).
  3. Behandle cellene med 1 ml trypsin-etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) for å løsne cellene ved å inkubere ved 37 °C i 3-5 minutter.
  4. Legg til 2 ml DMEM komplett media for å deaktivere trypsinet og samle cellene i et sentrifugeringsrør.
  5. Pellet cellene ved 2,348 × g i 5 minutter.
  6. Vask pelleten med 1x PBS og sentrifuge ved 2 348 × g i 5 minutter.
  7. Oppbevar pelleten ved -80 °C inntil videre bruk.
    MERK: Celleantallet kan variere avhengig av cellelinjen. Vi fikk omtrent 2,5 × 106 celler i tilfelle av A2780-cellelinjen, som brukes i ytterligere trinn.

2. Genomisk DNA-isolasjon

  1. Tilsett 500 μL lysisbuffer (10 mM tris-Cl, pH 8,0; 25 mM EDTA, pH 8,0; 100 mM NaCl; 0,5 % w/v natriumdodecylsulfat) til cellepelleten og bland forsiktig med en kuttspiss (med en åpningsdiameter på minimum 2 mm). Tilsett 20 μg/ml nylaget RNase A og bland forsiktig ved inversjon.
  2. Inkuber ved 37 °C i 30 minutter og snu av og til røret under inkubasjon.
  3. Tilsett proteinase K til en endelig konsentrasjon på 100 μg/ml og bland forsiktig ved inversjon 10 ganger. Inkuber ved 55 °C i 2 timer. Inverter røret med jevne mellomrom (hvert 10. minutt) under inkubasjon.
  4. Tilsett 500 μl fenol: kloroform: isoamylalkoholreagens (25: 24: 1) og bland forsiktig ved inversjon 20 ganger. Sentrifuge ved 9 391 × g i 15 minutter ved romtemperatur (ca. 25 °C).
    MERK: Figur 1A viser de tre lagene oppnådd etter sentrifugering.
  5. Fjern det viskøse øvre vandige laget ut av de tre synlige lagene, legg inn i et nytt rør ved hjelp av en kuttspiss, og tilsett like mye kloroform. Bland med mild inversjon 20 ganger.
  6. Sentrifuger rørene ved 9 391 × g i 15 minutter ved romtemperatur.
  7. Samle det vandige laget og tilsett en passende mengde 5 M NaCl slik at den endelige konsentrasjonen av NaCl er 0,2 M.
  8. Tilsett to volumer 100% etanol. Bland med mild inversjon 20-25 ganger. Sentrifuge ved 15 871 × g i 5 min ved romtemperatur.
  9. Fjern supernatanten og tilsett 500 μL 70% etanol for å vaske pelleten. Sentrifuge ved 15 871 × g i 5 min ved romtemperatur.
  10. Fjern supernatanten, lufttørk pelleten i noen minutter, og tilsett 50 μL sterilt nukleasefritt vann. La DNA rehydrere i 1-2 dager ved romtemperatur. Bland ved pipettering, ved hjelp av kuttspissen.
  11. Mål konsentrasjonen av DNA ved hjelp av ultrafiolett (UV)-spektrofotometri. Fortynn prøvene, om nødvendig, ved hjelp av sterilt nukleasefritt vann for å få en minimumskonsentrasjon på 300-500 ng / μL.
  12. Sjekk for integriteten til DNA ved å kjøre den på en 1% agarosegel (figur 1B).
  13. Oppbevar det fortynnede DNA ved -20 °C inntil videre bruk.

3. Fordøyelse av genomisk DNA

  1. Forbered en enzymblanding av Rsa1 (20 U) og Hinf1 (20 U) og tilsett 2 μL restriksjonsfordøyelsesbuffer per reaksjon.
  2. Ta et passende volum genomisk DNA slik at den totale mengden DNA er 1,5 μg. Fyll volumet med sterilt nukleasefritt vann, slik at totalvolumet etter enzymtilsetningen er 20 μL.
  3. Bland godt ved å banke, etterfulgt av et pulsspinn.
  4. Inkuber blandingen ved 37 °C i 2 timer.

4. Agarosegelelektroforese

  1. Forbered en 10 cm × 15 cm 0,8% agarosegel i 1x tris acetat EDTA (TAE) buffer ved bruk av høyverdig agarose.
  2. Tilsett 5 μL lastfargestoff til hver fordøyd genomisk DNA-prøve, slik at det endelige volumet blir 25 μL, og legg prøvene på gelen.
  3. Forbered en molekylær markørblanding ved å bruke 1 μL molekylær markør (stige), 3 μL sterilt nukleasefritt vann og 1 μL 5x lastfargestoff.
  4. Last inn 5 μL molekylær markørblanding på begge sider av de genomiske DNA-fordøyde prøvene hvis det er et høyere antall prøver (~ 10), eller bare på den ene siden hvis det er mindre enn eller lik fem prøver.
  5. Kjør gelen på 5 V/cm i 6 timer. Når kjøringen er fullført, lag et hakk på det ene hjørnet av gelen for å markere lasterekkefølgen.
  6. Senk gelen i 0,25 M HCl i 10 minutter ved romtemperatur ved forsiktig omrøring.
  7. Skyll gelen to ganger med destillert vann.
  8. Denaturer DNA ved å senke gelen i en oppløsning på 0,5 M NaOH og 1,5 M NaCl to ganger i 15 minutter hver ved romtemperatur med forsiktig omrøring.
  9. Skyll gelen to ganger med destillert vann.
  10. Nøytraliser DNA ved å senke gelen i en løsning på 0,5 M tris-HCl og 3 M NaCl (pH 7,5) to ganger i 15 minutter ved romtemperatur med forsiktig omrøring.

5. Sørlig blotting

  1. Klipp en nylonmembran på 10 cm × 12 cm i størrelse og lag et hakk i samme posisjon som gelen.
  2. Aktiver membranen ved å dyppe i destillert vann etterfulgt av 20x natriumsaltvannsitrat (SSC) buffer (se tabell 1).
  3. Sett opp overføringen.
    1. Ta et rent glassbrett og legg et annet brett i det i omvendt stilling. Lag en veke ved hjelp av vanlig filterpapir slik at endene berører bunnen av den ytre skuffen.
    2. Legg gelen på toppen av filterpapiret. Legg den aktiverte nylonmembranen forsiktig over gelen, med hakkene overlappende, og fjern eventuelle luftbobler ved å rulle over en glassstang.
    3. Plasser en 2 cm haug på 9,5 cm × 11,5 cm cellulosefilterpapir, etterfulgt av en 6 cm haug med vanlig filterpapir med samme dimensjoner. Plasser en vekt på toppen av dette oppsettet slik at det er lik vektfordeling under. Fyll den ytre skuffen med 20x SSC-buffer (se figur 2).
    4. La oppsettet stå for overføring over natten.
  4. Etter den sørlige overføringen, fest det overførte DNA på membranen ved UV-tverrbinding på en UV-transilluminator eller UV-tverrbinder. Bruk en 302 nm 8 W lampe i 5 min, eller en 254 nm 8 W lampe i 2 min, noe som tilsvarer ca. 120 mJ. Forsikre deg om at membransiden som DNA overføres på, vender mot lampen.
  5. Vask membranen to ganger med 25 ml 2x SSC-buffer.
  6. Sett protokollen på pause, om nødvendig, ved å tørke flekken helt og oppbevare den ved 2-8 °C etter løst innpakning i folie, til videre behandling.

6. Hybridisering og deteksjon av kjemiluminescens

  1. Forvarm prehybridiseringsbufferen til 42 °C.
    MERK: Følgende trinn inkluderer volumer av løsninger/buffere som skal brukes per 100 cm2 flekk.
  2. Inkuber membranen i 10 ml prehybridiseringsbuffer i 1 time ved 42 °C ved forsiktig omrøring for prehybridisering.
  3. Tilsett 0,5 μL telomersonde per 5 ml forvarmet prehybridiseringsbuffer for å lage hybridiseringsløsningen.
  4. Inkuber blottet i 10 ml hybridiseringsoppløsning ved 42 °C i 3 timer med forsiktig omrøring.
  5. Vask blottet med streng buffer 1 (tabell 1) to ganger i 10 minutter (25 ml hver) ved romtemperatur med forsiktig omrøring.
  6. Forvarm streng buffer 2 (tabell 1) i 30 minutter ved 50 °C.
  7. Vask blotten med streng buffer 2 to ganger i 15 minutter (25 ml hver) ved 50 °C med forsiktig omrøring.
  8. Skyll med 15 ml vaskebuffer i 5 min ved forsiktig omrøring ved RT.
  9. Inkuber membranen i 10 ml nytilberedt 1x blokkeringsløsning i 30 minutter ved romtemperatur med forsiktig omrøring.
  10. Inkuber membranen i 10 ml anti-digioxigenin konjugert med alkalisk fosfatase arbeidsløsning (se tabell 2) i 30 minutter ved RT med mild omrøring.
  11. Vask blotten to ganger med vaskebuffer ved romtemperatur i 15 min med forsiktig omrøring.
  12. Inkuber i 10 ml deteksjonsbuffer i 5 minutter ved RT med mild omrøring.
  13. Fjern overflødig deteksjonsbuffer og hold membranen med DNA vendt oppover på en hybridiseringspose eller acetatark. Tilsett ~ 1-1,5 ml substratløsning dråpevis på membranen, legg umiddelbart et annet ark på det, og inkuber i 5 minutter ved RT.
  14. Klem ut overflødig substratløsning for avbildning.
  15. Avbilde blotten i omtrent 20 minutter i et geldokumentasjonsbildesystem, og samle flere bilder på forskjellige tidspunkter. Velg umettede bilder for videre analyse.
    MERK: Hvis signalet er svakt, kan avbildning utføres over lengre tid.

7. Analyse

  1. Etter å ha hentet bildefilene, eksporter du dem for publisering i .tif format med høyest mulig oppløsning (600 dpi i dette tilfellet).
  2. Installer Telotool programvare. Dette krever en spesifikk versjon (R2012a) av MATLAB (fritt tilgjengelig) for å kjøre.
  3. Åpne programvaren og klikk på Last inn bildefil-knappen øverst til høyre.
  4. Etter at bildet er lastet inn, klikker du på Inverter bilde, slik at bildebakgrunnen er svart og flekkene/båndene er hvite.
  5. Beskjær bildet med de øverste hjørnene som starter fra brønnene. Etter at beskjæringsvalget er gjort, høyreklikker du i det og velger Beskjær bilde.
  6. Etter at bildet er beskåret, klikker du på Beregn kjørefelt og lar kjørefeltdeteksjon skje automatisk.
  7. Hvis kjørefeltene ikke er oppdaget riktig, for eksempel hvis visse kjørefelt ikke er oppdaget i det hele tatt, eller hvis ekstra eller delvis kjørefelt er oppdaget, utfør kjørefeltjustering som beskrevet nedenfor.
    1. Klikk på Juster kjørefelt og i popup-vinduet som åpnes, legg til og / eller juster baner etter behov, og klikk på Bruk og lukk.
  8. Etter å ha justert banene, sørg for at du ser en rød prikk på hver av banene og juster stigene ved hjelp av Ladder Fit-knappen , og sørg for at antall topper i begge stigebanene er i samme posisjon. Fjern eventuelle overflødige topper ved hjelp av Slett ekstremum-knappen .
  9. Etter at stigene er justert, velg Lane Profiles, klikk på Ladder Fit, og velg Polynom Fit.
  10. Klikk på Trendline, som anbefalt av programvaren, og velg deretter Korrigert i neste alternativ.
  11. Klikk på Få resultater for å vise resultatene som en tabell, der gjennomsnittlig TRF-rad er telomerlengdemåling av de respektive kjørefeltprøvene.
  12. Klikk på Lagre alle for å lagre resultatene i form av et regneark.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det ekstraherte genomiske DNA (gDNA), som ble kjørt på en 1% agarosegel, viste god integritet, som vist i figur 1B, noe som indikerer at prøven kunne brukes til videre nedstrøms prosessering av TRF. TRF-analysen ble deretter utført ved å modifisere volumene av løsninger som kreves på hvert trinn (se tabell 1 og tabell 2). TRF-signalet var godt synlig (figur 3). Ved å modifisere løsningsvolumer og konsentrasjoner kunne derfor flere prøver behandles uten negativ effekt på resultatene, og telomerlengden kunne bestemmes vellykket ved hjelp av fritt tilgjengelig programvare som Telotool10.

Figure 1
Figur 1: Isolering og kvalitetskontroll av genomisk DNA. (A) Tre distinkte separasjonsfaser oppnådd ved sentrifugering etter tilsetning av fenol: kloroform: isoamylalkohol. Det øvre vandige laget inneholder gDNA, interfasen inneholder proteinene, og den nedre, organiske fasen inneholder nedbrutt RNA, celleavfall og lipider. (B) Et bilde av en 1% agarosegel som viser intakt ufordøyd gDNA. Lane 1 viser en stige på 1 kb og bane 2 viser ufordøyd gDNA fra kreftcellelinjen A2780. Forkortelse: gDNA = genomisk DNA. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Illustrasjon av overføringsoppsett for sørlig blotting. Representativt diagram som viser systemenheten for overføring av telomerrepetisjonsutstryk fra gelen til nylonmembranen ved kapillærvirkning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Kjemiluminescensdeteksjon av TRFer etter sørlig blotting og hybridisering. Blot som viser en rekke telomeriske repetisjoner som smøring i bane 2. Lane 1 viser en molekylær markør, med molekylvektene (kb) av bånd angitt på venstre side. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: Liste over reagenser brukt i denne protokollen. Tabellen inneholder reagenser fremstilt i laboratoriet sammen med deres lagringsdetaljer, anbefalt bruk av TAGGG telomerlengdeanalysesettreagenser og deres modifiserte bruksvolumer, i henhold til optimaliseringen i denne protokollen. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 2: Liste over kommersielt tilgjengelige reagenser med modifiserte bruksanvisninger. Tabellen inneholder kommersielt tilgjengelige reagenser sammen med forskjellige fortynninger, deres lagringsdetaljer og deres anbefalte bruk av TAGGG telomerlengdeanalysesett og modifiserte bruksvolumer, i henhold til optimaliseringen i denne protokollen. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi beskriver en detaljert prosedyre for en ikke-radioaktiv, kjemiluminescensbasert metode for telomerlengdemåling med sørlig blotting. Protokollen er testet for å tillate fornuftig bruk av flere reagenser uten at det går ut over kvaliteten på resultatene. Prehybridiserings- og hybridiseringsbufferen kan gjenbrukes opptil fem ganger. Enzymkonsentrasjonen kan variere mellom 10-20 U per 1,5-2 μg genomisk DNA uten å påvirke resultatene. Flere andre settkomponenter, som den DIG-merkede molekylvektmarkøren og hybridiseringssonden, kan brukes ved lavere konsentrasjoner enn anbefalt. De optimaliserte volumene er angitt i tabell 2. Vi har testet dem ved halvparten av anbefalte volumer/konsentrasjoner og funnet optimal ytelse. Ved å følge disse trinnene reduseres kostnaden per prøve enormt, slik at forskerne kan måle telomerlengden ved hjelp av denne metoden i større skala.

Det finnes flere publiserte TRF-protokoller. Vi har optimalisert den kommersielt tilgjengelige settprotokollen for å gjøre den kostnadseffektiv. Denne protokollen er forskjellig fra noen av de publiserte protokollene da den ikke bruker radioaktivitet11,12. Det er også relativt enkelt, da det bruker settkomponentene i stedet for å forberede interne reagenser, spesielt telomersonden13.

Hvis det endelige bildet er ujevnt, har membranen delvis tørket under inkubasjon. For å løse dette bør man enten øke løsningsvolumet eller agitere med høyere hastighet. Hvis det ikke er synlige flekker på flekken, kan det ha vært et problem under den sørlige overføringen. I tillegg kan det ha vært et problem i DNA-mengden eller kvaliteten.

Det er noen begrensninger for denne metoden. For det første tar genomisk DNA-ekstraksjon og kvantifisering oppover 4 dager basert på kilden til DNA14. DNA med høyere molekylvekt tar lengre tid å rehydrere og homogenisere, noe som gjør kvantifisering og nøyaktig pipettering vanskelig. For det andre er TRF-protokollen lang (minimum 2 dager) og krever dyktige laboratoriearbeidere å implementere. Det er også en kostbar metode på grunn av reagensene og mengdene som kreves. TRF-protokollen måler også gjennomsnittlig telomerlengde i hver prøve, i motsetning til den korteste telomerlengden som TESLA måler eller telomerlengden per celle som flowcytometribaserte metoder gir15. En annen begrensning ved TRF-analyse ved bruk av enzymene som brukes her, er en overestimering av telomerlengde, da disse enzymene ikke har et restriksjonssted i de sub-telomeriske områdene15.

Til tross for begrensningene er det imidlertid grunner til at denne metoden fortsatt regnes som gullstandarden for telomerlengdemåling. Telomerlengder gjengis nøyaktig i absolutte verdier i kilobasepar (kbp).

Denne metoden kan brukes til å måle gjennomsnittlig telomerlengde i en rekke celletyper, fra cellelinjer 16,17 til buffy coat pellets 18,19. Dette gjør det til en robust metode å bruke i flere typer forskningsstudier. Det kan også brukes i store epidemiologiske studier, samt i studier der cellebaserte terapier utvikles.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi ønsker å anerkjenne Ms Prachi Shah for å hjelpe oss i utgangspunktet med protokolloptimalisering. Vi vil gjerne takke Dr. Manoj Garg for å gi A2780 eggstokkreft cellelinje. EK støttes av et forskningsstipend fra Institutt for bioteknologi (nr. BT/RLF/Re-entry/06/2015), Department of Science and Technology (ECR/2018/002117), og NMIMS Seed Grant (IO 401405).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Line
A2780 (Ovarian adenocarcinoma cell line) Received as a gift
Equipment
ChemiDoc XRS+ (for imaging and UV cross linking) Biorad Universal hood II (721BR14277)
Nanodrop (Epoch 2) Biotek EPOCH2
Software
TeloTool Version 1.3
Materials
Acetic Acid Molychem 64-19-7
Agarose MP 180720
Amphotericin B Gibco, ThermoFisher Scientific, USA 15240062
DMEM  HyClone, Cytiva, USA SH30243.01
Ethylenediamine tetraacetic acid  Molychem 6381-92-6
HI FBS Gibco, ThermoFisher Scientific, USA 10270106
HCl Molychem 76-47-01-0
NaCl Molychem 7647-14-5
NaOH Molychem 1310-73-2
Nylon membrane Sigma 11209299001
Penicillin Gibco, ThermoFisher Scientific, USA 15240062
Sodium dodecyl sulfate Affymetrix 151-21-3
Streptomycin Gibco, ThermoFisher Scientific, USA 15240062
Tris BIORAD 77-86-1
Tris HCl Sigma Aldrich 1185-53-1
Whatman paper GE healthcare lifesciences 1001-917
Reagents
1 kb ladder NEB N3232S
20x SSC Invitrogen 15557-036
Anti DIG AP Telo TAGGG Telomere Length Assay kit 12209136001
Blocking solution 10x Telo TAGGG Telomere Length Assay kit 12209136001
Cutsmart Buffer NEB B6004
Detection buffer 10x Telo TAGGG Telomere Length Assay kit 12209136001
Dig easy hyb Telo TAGGG Telomere Length Assay kit 12209136001
Digestion Buffer Telo TAGGG Telomere Length Assay kit 12209136001
Hinf 1 Telo TAGGG Telomere Length Assay kit 12209136001
Hinf 1 (alternative to kit) NEB R0155T
Loading Dye BIOLABS N3231S
Maleic acid buffer 10x Telo TAGGG Telomere Length Assay kit 12209136001
Molecular marker Telo TAGGG Telomere Length Assay kit 12209136001
Probe Telo TAGGG Telomere Length Assay kit 12209136001
Rsa 1 Telo TAGGG Telomere Length Assay kit 12209136001
Rsa 1 (alternative to kit) NEB R0167L
Substrate Telo TAGGG Telomere Length Assay kit 12209136001
Wash buffer Telo TAGGG Telomere Length Assay kit 12209136001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Greider, C. W. Telomere length regulation. Annual Review of Biochemistry. 65, 337-365 (1996).
  2. Valdes, A. M., et al. Obesity, cigarette smoking, and telomere length in women. Lancet. 366 (9486), 662-664 (2005).
  3. Allsopp, R. C., et al. Telomere length predicts replicative capacity of human fibroblasts. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (21), 10114-10118 (1992).
  4. Epel, E. S., et al. Accelerated telomere shortening in response to life stress. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (49), 17312-17315 (2004).
  5. Canela, A., Vera, E., Klatt, P., Blasco, M. A. High-throughput telomere length quantification by FISH and its application to human population studies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (13), 5300-5305 (2007).
  6. Révész, D., Milaneschi, Y., Verhoeven, J. E., Penninx, B. W. Telomere length as a marker of cellular aging is associated with prevalence and progression of metabolic syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 99 (12), 4607-4615 (2014).
  7. Rizvi, S., Raza, S. T., Mahdi, F. Telomere length variations in aging and age-related diseases. Current Aging Science. 7 (3), 161-167 (2014).
  8. Mender, I., Shay, J. W. Telomere restriction fragment (TRF) analysis. Bio-Protocol. 5 (22), e1658 (2015).
  9. Zhu, Y., Liu, X., Ding, X., Wang, F., Geng, X. Telomere and its role in the aging pathways: telomere shortening, cell senescence and mitochondria dysfunction. Biogerontology. 20 (1), 1-16 (2019).
  10. Göhring, J., Fulcher, N., Jacak, J., Riha, K. TeloTool: a new tool for telomere length measurement from terminal restriction fragment analysis with improved probe intensity correction. Nucleic Acids Research. 42 (3), 21 (2014).
  11. Jenkins, F. J., Kerr, C. M., Fouquerel, E., Bovbjerg, D. H., Opresko, P. L. Modified terminal restriction fragment analysis for quantifying telomere length using in-gel hybridization. Journal of Visualized Experiments. (125), e56001 (2017).
  12. Fojtová, M., Fajkus, P., Sováková, P. P., Fajkus, J. Terminal restriction fragments (TRF) method to analyze telomere lengths. Bio-protocol. 5 (23), e1671 (2015).
  13. Kimura, M., et al. Measurement of telomere length by the Southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths. Nature Protocols. 5 (9), 1596-1607 (2010).
  14. Trigodet, F., et al. High molecular weight DNA extraction strategies for long-read sequencing of complex metagenomes. Molecular Ecology Resources. 22 (5), 1786-1802 (2022).
  15. Lai, T. P., Wright, W. E., Shay, J. W. Comparison of telomere length measurement methods. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 373 (1741), 20160451 (2018).
  16. Mochida, A., et al. Telomere size and telomerase activity in Epstein-Barr virus (EBV)-positive and EBV-negative Burkitt's lymphoma cell lines. Archives of Virology. 150 (10), 2139-2150 (2005).
  17. Gupta, N., et al. Replicative senescence, telomere shortening and cell proliferation rate in Gaddi goat's skin fibroblast cell line. Cell Biology International. 31 (10), 1257-1264 (2007).
  18. Michaeli, J., et al. Leukocyte telomere length correlates with extended female fertility. Cells. 11 (3), 513 (2022).
  19. Lesmana, A., et al. Continuous reference intervals for leukocyte telomere length in children: the method matters. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 59 (7), 1279-1288 (2021).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 194
Optimalisering av ytelsesparametere for TAGGG-telomerlengdeanalysen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jain, M., Madeka, S., Khattar, E.More

Jain, M., Madeka, S., Khattar, E. Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay. J. Vis. Exp. (194), e65288, doi:10.3791/65288 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter