Summary

Mikropsuz eşekarısı yetiştirme prosedürünün optimize edilmesi

Published: July 21, 2023
doi:

Summary

Nasonya yaban arısı embriyoları, 12-24 saat boyunca parazitizasyondan sonra Lucillia sericata pupalarından diseke edildi ve mikropsuz embriyolar elde etmek için alkol ve% 10 sodyum hipoklorit çözeltisi ile yıkandı. Mikropsuz embriyoları yetiştirdikten ve in vitro olarak büyümek ve gelişmek için onlara Nasonya yetiştirme ortamı sağladıktan sonra, mikropsuz Nasonia yetişkinleri elde edildi.

Abstract

Aseptik yetiştirme teknolojisi, dış mikroorganizmaların böcek mikrobiyotası üzerindeki etkisini etkili bir şekilde ortadan kaldırabilen ve böylece böcek mikrobiyota araştırmalarının hızlı gelişimini teşvik edebilen steril veya neredeyse steril koşullar altında böceklerin kültürlenmesi için bir yöntemdir. Nasonia (yaban arısı cinsi), kısa ömürlü, yüksek genetik çeşitlilik, kolay kullanım vb. gibi birçok avantajı olan ve böcek model sistemi olarak yaygın olarak kullanılan parazitik bir yaban arısı böceğidir. Sadece hayvanlardaki mikroorganizma sayısını azaltabilen antibiyotik tedavisinin aksine, aseptik yetiştirme teknikleri, hayvanlardaki mikroorganizmaların hem bileşimini hem de miktarını kontrol edebilir ve konakçı-mikrop etkileşimlerinin incelenmesini daha da kolaylaştırabilir. Bununla birlikte, Nasonya yetiştirme ortamının (NRM) önceki sürümleri, karmaşık ve zaman alıcı bir hazırlama süreci, bakteri veya mantarlar tarafından kolay kontaminasyon ve kısa depolama süresi gibi bazı kusurlara ve sorunlara sahiptir. Bu nedenle, bu çalışma NRM hazırlama sürecinde kullanılan araçları, depolama koşullarını ve bileşen oranlarını optimize ederek bu sorunları çözmektedir. Optimize edilmiş ortam, en az 3 ay boyunca -20 ° C’de depolamaya izin verebilir ve steril eşekarısı beslemesi sırasında NRM kontaminasyonu olasılığını ortadan kaldırabilir. Bu, Nasonya’yı mikrobiyal araştırmalar için bir model olarak kullanmak için önemli olan aseptik Nasonya’nın hayatta kalma oranını ve sağlık seviyesini daha da artırır.

Introduction

Mikropsuz hayvanlar, tespit edilebilir canlı mikroorganizmalara ve parazitlere sahip olmayan hayvanlardır1. Mikropsuz embriyolar, annenin aseptik koşullar altında diseke edilmesi ve daha sonra bariyer sistemlerde yetiştirilmesi ile elde edilebilir2. Bu tür hayvanlar, mikroorganizmaların bağırsak mikrobiyotası, bağışıklık sistemi ve metabolizma 1 gibi hayvanlar üzerindeki etkilerini incelemek içinkullanılabilir. Bazı teknik araçlarla, birçok böcek ve hatta memeliler steril hale getirilebilir 3,4. Mikropsuz hayvanlar benzersiz bir role sahiptir ve mikrobiyoloji araştırmalarının çeşitli yönlerinde yaygın olarak kullanılmaktadır5. Örneğin, mikropsuz Nasonia yaban arılarının kullanımı, mikroorganizmaların konakçıların uzun süreli eksojen çevresel stres altında yeni ortamlara uyum sağlamasına yardımcı olabileceğini ortaya koymuştur 6,7.

Nasonia parazitoidleri, yumurtalarını sineklerin pupalarına enjekte eden küçük parazitik eşekarısıdır4. Nasonia vitripennis, Nasonia longicornis, Nasonia giraulti ve Nasonia oneida 8 dahil olmak üzere bilinen dört Nasonia türü vardır. N. vitripennis dünya çapında bulunabilirken, diğer üç türün Kuzey Amerika’da sınırlı aralıkları vardır4. Nasonya parazitoid eşekarısı, kolay ekim, kısa üreme döngüsü, dizilenmiş genom ve uzun süreli diapause 8,9 gibi özellikleri nedeniyle ideal model böcekler olarak kabul edilir. Böcek evrimi, genetik, gelişim, davranış ve simbiyoz10’un çeşitli yönlerini incelemek için kullanılabilirler. Ayrıca, Nasonia parazitoid eşekarısı da tarım ve hastalık11’de zararlı sineklerin kontrolüne yardımcı olabilir. Steril bir böcek sisteminin başarılı bir şekilde kurulması iki ana adımı içerir: (1) embriyoların sterilizasyonu ve (2) larvalara in vitro steril gıda sağlanması. Steril gıda elde etmek için Brucker ve Bordenstein 12, bakterileri öldürmek için antibiyotik, ağartıcı ve fetal sığır serumu gibi kimyasallar kullanarak 2012 yılında Nasonya yetiştirme ortamını (NRMv1) geliştirdi12. Bununla birlikte, kimyasal sterilizasyon yöntemi, N. vitripennis13’ün düşük sağkalım ve eklosyon oranlarına neden olmuştur. Daha sonra, 2016 yılında, Shropshire ve ark., antibiyotiklerin ve diğer maddelerin tehlikelerini ortadan kaldırmak için kimyasal sterilizasyon yöntemi yerine bir filtre sterilizasyon yöntemi kullanarak NRMv2’yi geliştirdi ve üreme sürecini optimize etti13. Ne yazık ki, bu yöntemin hala ortamın hazırlanması ve kullanılmasıyla ilgili zorlukların yanı sıra embriyolar, larvalar ve kapalı pupalar için boğulma, yetersiz beslenme veya dehidrasyon riskleri gibi bazı dezavantajları vardır14. Wang ve Brucker14 yakın zamanda Nasonia yetiştirme ortamı sürüm 3 (NRMv3) ve mikropsuz yetiştirme sürüm 2 (GFRv2) protokollerini geliştirdi. Bu iyileştirmeler maliyeti ve medya tüketimini azalttı. Bununla birlikte, NRMv3 çok kısa bir depolama süresine sahiptir ve kontaminasyona karşı oldukça hassastır.

NRMv3 üzerine inşa edilen NRM hazırlama aracı depolama yöntemi ve besin oranı bu çalışmada optimize edilmiştir. Bu metodolojik arıtma, N. vitripennis’in mikrobiyom çalışmaları için bir model olarak kullanılmasını kolaylaştırır. Wang ve ark.14 tarafından geliştirilen NRMv3 ile karşılaştırıldığında, NRM hammaddelerinden biri olan Sarcophaga bullata pupa’yı sıkmak için geliştirilmiş araç, Wang ve ark.14 tarafından kullanılan bir alt deliğe sahip 60 mL şırıngaya kıyasla S. bullata pupa doku sıvısının üretim verimliliğini büyük ölçüde artırmaktadır. NRM’nin besin oranını ayarladık, bu da mikropsuz Nasonya eşekarısının hayatta kalma oranında, gelişim sürelerini etkilemeden belirli bir artışa yol açtı. Ek olarak, NRM küçük kapasiteli santrifüj tüplerine (1,5 mL) paketlendi ve depolama süresini uzatmak için -20 ° C’lik bir buzdolabında donduruldu. Ev sineği Lucilia sericata’yı NRM hazırlığı için konakçı ve kaynak olarak kullanırken, bu protokolün laboratuvarda bulunan diğer Nasonia konakçıları için uyarlanabileceğini belirtmek gerekir.

Protocol

1. Mikropsuz Nasonia yetiştirme ortamının hazırlanması Piyasada satılan L. sericata pupalarını (bkz. Malzeme Tablosu) tepsi veya kağıt gibi tüm pupaları barındırabilecek bir yüzeye yerleştirin. Az gelişmiş larvaları, koyu yaşlı pupaları, boş pupa kabuklarını, talaşları veya diğer safsızlıkları atın. Sadece kahverengimsi-kırmızı renkli genç pupaları saklayın ve bunları bir behere (yaklaşık 3.000-4.000 p…

Representative Results

NRM’nin hazırlık verimliliği, hazırlık araçları geliştirilerek büyük ölçüde iyileştirildi. Ek olarak, besleme sürecindeki NRM kirliliği sorunu, strateji ve koruma yöntemi optimize edilerek ortadan kaldırılmıştır. Aynı zamanda, ayarlanmış NRM, konakçı olarak L. sericata ile mikropsuz eşekarısının büyümesi ve gelişmesi için daha uygun bir beslenme oranına sahipti. Larvalardan pupalara kadar mikropsuz eşekarısının hayatta kalma oranı, GFRv3 kullanılarak NRMv2 ile yetiştiri…

Discussion

Genomik ve metabolomik gibi yüksek verimli tespit teknolojilerinin uygulanmasıyla, araştırmacılar yavaş yavaş bağırsak mikrobiyotasında büyük genetik çeşitlilik ve metabolik karmaşıklık olduğunu fark ettiler16. Bu simbiyotik bakteriler, konakçı beslenme metabolizması, tümörler, bağışıklık ve konakçı ile karmaşık etkileşimler yoluyla yaşlanma gibi çeşitli fizyolojik veya patolojik durumlarla yakından ilişkilidir17. Bununla birlikte, kona…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Finansman: Bu çalışma, Çin Ulusal Bilim Vakfı (32270538), Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (2022YFF0710603), Pekin Doğa Bilimleri Vakfı (6222046) ve G.H.W. Yazar katkılarına verilen CAS-CSIRO finansman programı (152111KYSB20210011) aracılığıyla CAS stratejik finansmanı tarafından desteklenmiştir: tüm yazarlar derlemenin kapsamını ve odağını geliştirmiş ve makalenin yazılmasına katkıda bulunmuştur.

Materials

0.22 Sterile vacuum filter NEST 331011
10% SodiumHypochlorite LIRCON XB-84BS-1
1x PBS solution Solarbio P1020
200 mesh nylon net BIOBYING BY-378Z
24 well-plate NEST 702001
8, 1.2, 0.8, and 0.45 µm filters Shanghai Xingya Purification Material Factory HN-AA-JT-10079
Absolute ethyl alcohol Macklin E809057-500ml
Cell Strainer BIOLOGIX 15-1100
Commercial Drosophila Medium Boer B645446-500ml
Dissecting needle Bioroyee 17-9140
Garlic press Taobao No Catalog numbers Purchase on Taobao
Lucillia sericata pupae Hefei Dayuan Biotechnology Co., Ltd. No Catalog numbers Purchase on Taobao
Small writing brush Cestidur BL0508
Stereoscope SOPTOP RX50
Tweezers SALMART A109001-56

References

  1. Diviccaro, S., et al. Exploring the impact of the microbiome on neuroactive steroid levels in germ-free animals. International Journal of Molecular Sciences. 22 (22), 12551 (2021).
  2. Pang, X., et al. Inter-species transplantation of gut microbiota from human to pigs. The ISME Journal. 1 (2), 156-162 (2007).
  3. Uzbay, T. Germ-free animal experiments in the gut microbiota studies. Current Opinion in Pharmacology. 49, 6-10 (2019).
  4. Zhu, Z., Liu, Y., Hu, H., Wang, G. -. H. Nasonia-microbiome associations: a model for evolutionary hologenomics research. Trends in Parasitology. 39 (2), 101-112 (2022).
  5. Li, J., Wei, H. Establishment of an efficient germ-free animal system to support functional microbiome research. Science China Life Sciences. 62 (10), 1400-1403 (2019).
  6. Wang, G. H., et al. Changes in microbiome confer multigenerational host resistance after sub-toxic pesticide exposure. Cell Host Microbe. 27 (2), 213-224 (2020).
  7. Wang, G. H., Dittmer, J., Douglas, B., Huang, L., Brucker, R. M. Coadaptation between host genome and microbiome under long-term xenobiotic-induced selection. Science Advances. 7 (19), (2021).
  8. Dittmer, J., Brucker, R. M. When your host shuts down: larval diapause impacts host-microbiome interactions in Nasonia vitripennis. Microbiome. 9 (1), 85 (2021).
  9. Dittmer, J., et al. Disentangling a holobiont-recent advances and perspectives in Nasonia wasps. Frontiers in Microbiology. 7, 1478 (2016).
  10. Brooks, A. W., Kohl, K. D., Brucker, R. M., van Opstal, E. J., Bordenstein, S. R. Phylosymbiosis: relationships and functional effects of microbial communities across host evolutionary history. PLoS Biology. 14 (11), e2000225 (2016).
  11. Heavner, M. E., et al. Partial venom gland transcriptome of a Drosophila parasitoid wasp, Leptopilina heterotoma, reveals novel and shared bioactive profiles with stinging Hymenoptera. Gene. 526 (2), 195-204 (2013).
  12. Brucker, R. M., Bordenstein, S. R. In vitro cultivation of the hymenoptera genetic model, Nasonia. PLoS One. 7 (12), e51269 (2012).
  13. Shropshire, J. D., van Opstal, E. J., Bordenstein, S. R. An optimized approach to germ-free rearing in the jewel wasp Nasonia. PeerJ. 4, e2316 (2016).
  14. Wang, G. H., Brucker, R. M. An optimized method for Nasonia germ-free rearing. Scientific Reports. 12 (1), 219 (2022).
  15. Brucker, R. M., Bordenstein, S. R. The hologenomic basis of speciation: gut bacteria cause hybrid lethality in the genus Nasonia. Science. 341 (6146), 667-669 (2013).
  16. Fontaine, C. A., et al. How free of germs is germ-free? Detection of bacterial contamination in a germ free mouse unit. Gut Microbes. 6 (4), 225-233 (2015).
  17. Mazmanian, S. K., Liu, C. H., Tzianabos, A. O., Kasper, D. L. An immunomodulatory molecule of symbiotic bacteria directs maturation of the host immune system. Cell. 122 (1), 107-118 (2005).
  18. Weersma, R. K., Zhernakova, A., Fu, J. Interaction between drugs and the gut microbiome. Gut. 69 (8), 1510-1519 (2020).

Play Video

Cite This Article
Zhu, Z., Wang, D., Liu, Y., Tang, T., Wang, G. Optimizing the Rearing Procedure of Germ-Free Wasps. J. Vis. Exp. (197), e65292, doi:10.3791/65292 (2023).

View Video