In situ Imaging der Maus Thymus mit 2-Photonen-Mikroskopie

Summary

Wir präsentieren Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Erzeugung von Chimären Neugeborenen sowie die Präparation und Vorbereitung des Thymus für die Ex-vivo-Bildgebung durch 2-Photonen-Mikroskopie.

Abstract

Zwei-Photonen-Mikroskopie (TPM) ermöglicht es uns, Bild tief in den Thymus und dokumentieren die Ereignisse, die wichtig sind für die Thymozyten Entwicklung. Zu folgen, die Migration von Individuen in einer Menge von Thymozyten, generieren wir Neugeborenen Chimären, in denen weniger als ein Prozent der Thymozyten von einem Spender, dass transgene für ein ubiquitär ausdrückliche fluoreszierenden Proteins abgeleitet werden. Zur Erzeugung dieser partiellen hämatopoetischen Chimären sind neonatale Empfänger mit Knochenmark zwischen 3-7 Tage alt injiziert. Nach 4-6 Wochen wird die Maus getötet und die Thymusdrüse wird sorgfältig präpariert und bissected Erhaltung der Architektur des Gewebes, das abgebildet werden soll. Der Thymus ist auf einem Deckglas in der Vorbereitung für die Ex-vivo-Bildgebung von TPM geklebt. Während die Abbildung der Thymus ist in DMEM ohne Phenolrot mit 95% Sauerstoff und 5% Kohlendioxid durchströmt wird, und erwärmt auf 37 ° C gehalten Mit diesem Ansatz können wir untersuchen, die Ereignisse für die Erzeugung von einem vielfältigen T-Zell-Repertoires erforderlich.

Protocol

Adoptiven Transfer

Inject Neugeborenen mit 50-100 ul des Knochenmarks mit einer Insulin-Spritze 2-4 mal während der ersten 3-7 Tage des Lebens, mit einem letzten Donor-zu-Host-Verhältnis von 1:1. Ziel für eine Injektionsstelle unter dem Brustbein und Rippen, aber über dem Darm und Magen. Führen Sie die Nadel weit genug, um das Bauchfell, Achten Sie darauf, Punktion der Membran zu durchdringen. Es ist nicht ungewöhnlich für einen Teil der Knochenmark während der Injektion verloren zu sein. Sie können den Verlust durch Lösen Sie den Griff der Welpe zu reduzieren, wie Sie spritzen, um so lassen die Haut zu erweitern und dann langsam dem Entfernen der Nadel.

Präparation des Thymus

Machen Sie einen Schnitt durch die Mittellinie und schneiden oder reißen die Haut weg, um den Brustkorb zu offenbaren. Halten Sie das Brustbein und Durchtrennung des Bauchfells und des Zwerchfells. Cut die Seiten des Brustkorbs, die Brusthöhle zu offenbaren. Die Thymusdrüse liegt oben auf dem Herzen. So wie die Struktur des Thymus zu bewahren, auf das umliegende Gewebe, wie Sie aus sezieren die Thymusdrüse zu halten. Spülen Sie die Thymusdrüse mit PBS, um sie vor dem Austrocknen während der Präparation zu halten. Vorsichtig entfernt tease überschüssiges Gewebe auf der Oberfläche des Thymus Kapsel und halbieren die beiden Lappen.

Vorbereitung Tissue for Imaging

Verwenden Veterinär Gewebekleber zu kleben die Thymusdrüse nicht zu einem Quadrat Deckglas. Verwenden Sie einen pipetteman um den Bruchteil einer Mikroliter Kleber gesetzt. Verbreiten Sie den Kleber auf die ungefähre Länge und Breite des Thymus. Stetige Thymus gegen das Deckglas und ziehen Sie es an seinen Platz.

Zwei-Photonen-Imaging

Das Gewebe wird in DMEM ohne Phenolrot mit 95% Sauerstoff und 5% Kohlendioxid durchströmt wird, und erwärmt auf 37 ° C unter Wasser Zwei-Photonen-Anregung wurde mit einer Spectra-Physics MaiTai Laser abgestimmt auf 900nm und CFP, GFP, YFP und Texas Red Lichtemission wurde abgetrennt mit A 495, 515, 560 dichroitische Spiegel und sammelte mit PMT Detektoren.

Discussion

Zwei-Photonen-Imaging in den Thymus ermöglicht es uns, in lebendige, intakte Organe der Wechselwirkungen und Migrationen, die Auswahl Ereignisse im Thymus zugrunde zu untersuchen.