Summary
אנו מציגים צעד אחר צעד הוראות עבור הדור של מפלצות הילוד וכן לנתיחה והכנת התימוס עבור vivo לשעבר הדמיה על ידי מיקרוסקופית 2-פוטון.
Abstract
מיקרוסקופית שני הפוטונים (TPM) מאפשר לנו תמונה עמוק לתוך התימוס ולתעד את האירועים החשובים לפיתוח thymocyte. כדי לעקוב אחר המעבר של יחידים בתוך קהל של thymocytes, אנחנו מייצרים מפלצות בילוד שם פחות מאחוז אחד של thymocytes נגזרות תורם כי הוא מהונדס עבור חלבון פלואורסצנטי להביע בכל מקום בגוף. כדי להפיק אלה מפלצות hematopoetic חלקית, מקבלי בילוד מוזרקים עם מח עצם בין 3-7 ימים של גיל. לאחר 4-6 שבועות, העכבר הוא הקריב את התימוס הוא גזור בקפידה bissected שמירה על הארכיטקטורה של הרקמה יהיה הדמיה. התימוס הוא מודבק על coverslip כהכנה לשעבר vivo הדמיה על ידי TPM. במהלך הדמיה התימוס נשמר DMEM ללא פנול אדום כי הוא perfused עם 95% חמצן ופחמן דו חמצני 5% והתלהב 37 ° C. שימוש בגישה זו, אנו יכולים לחקור את האירועים הנדרשים עבור הדור של רפרטואר מגוון T התא.
Protocol
המאמצת העברת
הזרק בילודים עם 50-100ul של מח העצם באמצעות מזרק אינסולין 2-4 פעמים במהלך 3-7 הימים הראשונים לחייהם, עם יחס תורם ל-מארח הסופי של 01:01. מטרת אתר זריקה מתחת עצם החזה וכלוב הצלעות, אבל מעל המעיים והקיבה. הכנס את המחט רחוק מספיק כדי לחדור את הצפק, להיזהר לא לנקב את הסרעפת. אין זה נדיר עבור חלק במח העצם ללכת לאיבוד במהלך ההזרקה. ניתן להקטין את ההפסד על ידי התרופפות האחיזה שלך על הגור תוך כדי להזריק מנת לאפשר לעור להתרחב, ואז, לאט מוציא את המחט.
Dissection של קורנית
עושים חתך דרך קו האמצע לחתוך או לקרוע את העור ממנו כדי לחשוף את החזה. חכה עד עצם החזה וחתך דרך הצפק והסרעפת. חותכים את הצדדים של כלוב הצלעות כדי לחשוף את חלל בית החזה. בלוטת התימוס נמצאת בחלק העליון של הלב. לכן, כדי לשמר את המבנה של התימוס, לשמור על הרקמה הסובבת כפי שאתה לנתח את בלוטת התימוס. שוטפים את התימוס עם PBS לשמור אותו מהתייבשות במהלך הניתוח. בעדינות להקניט ממנו רקמה עודפת על פני השטח של הקפסולה הרתי ולחצות את שתי האונות.
הכנת רקמות for Imaging
השתמש דבק רקמות וטרינרי על הדבק התימוס שום coverslip ריבוע. השתמש pipetteman לשים שבריר microliter של דבק. מורחים את הדבק לאורך משוער והרוחב של התימוס. התימוס יציב נגד coverslip וגרור אותו למקומו.
שני הפוטונים הדמיה
רקמה היא שקוע DMEM ללא פנול אדום כי הוא perfused עם 95% חמצן ופחמן דו חמצני 5% והתלהב 37 ° C. עירור שני הפוטונים הושג באמצעות Spectra-Physics MaiTai לייזר מכוון 900nm, ו - CFP, ה-GFP, YFP וטקסס אור אדום פליטת הופרד באמצעות 495, 515, 560 מראות dichroic ואסף באמצעות גלאי PMT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הדמיה דו פוטון התימוס מאפשר לנו לבחון, איברים חיים שלמים אינטראקציות הגירות העומדים בבסיס האירועים מבחר בתוך התימוס.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
אנו מודים מאט פול ג'ימי וו לקבלת סיוע טכני.
References
- Kyewski, Seeding of thymic microenvironments defined by distinct thymocyte-stromal cell interactions is developmentally controlled. J Exp Med. 166, 520-538 (1987).
- Ladi, E., Yin, X., Chtanova, T., Robey, E. A. Thymic microenvironments for T cell differentiation and selection. Nat Immunol. 7, 338-343 (2006).
- Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. Directed Migration of Positively Selected Thymocytes Visualized in Real Time. PLoS Biol. 3, (2005).
