Summary
हम नवजात chimeras की पीढ़ी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विच्छेदन और 2-photon माइक्रोस्कोपी द्वारा पूर्व vivo इमेजिंग के लिए thymus की तैयारी के लिए कदम दर कदम निर्देश उपस्थित थे.
Abstract
दो photon माइक्रोस्कोपी (TPM) हमें thymus में गहरी छवि के लिए सक्षम बनाता है और घटनाओं है कि thymocyte विकास के लिए महत्वपूर्ण हैं दस्तावेज़. Thymocytes की एक भीड़ में व्यक्तियों के प्रवास का पालन करने के लिए, हम नवजात chimeras जहां thymocytes के एक प्रतिशत से भी कम है कि सर्वत्र व्यक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए ट्रांसजेनिक है एक दाता से प्राप्त कर रहे हैं उत्पन्न करते हैं. इन आंशिक hematopoetic chimeras उत्पन्न करने के लिए, नवजात प्राप्तकर्ताओं उम्र के 3-7 दिनों के बीच अस्थि मज्जा के साथ अंतःक्षिप्त रहे हैं. 4-6 सप्ताह के बाद, माउस और बलिदान और thymus ध्यान से dissected है और ऊतक कि imaged किया जाएगा की वास्तुकला के संरक्षण bissected. thymus coverslip पर TPM द्वारा पूर्व vivo इमेजिंग के लिए तैयारी में सरेस से जोड़ा हुआ है. इमेजिंग के दौरान thymus DMEM में phenol के लाल है कि 95% ऑक्सीजन और 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ perfused है और 37 को गरम डिग्री सेल्सियस के बिना रखा है इस दृष्टिकोण का उपयोग करना, हम एक विविध टी सेल प्रदर्शनों की सूची की पीढ़ी के लिए आवश्यक घटनाओं का अध्ययन कर सकते हैं.
Protocol
दत्तक स्थानांतरण
अस्थि मज्जा की 50 100ul एक इंसुलिन सिरिंज जीवन के पहले 3-7 दिनों के दौरान 2-4 बार का उपयोग कर एक अंतिम अनुपात 1:1 के दाता के लिए मेजबान के साथ, के साथ नवजात शिशुओं इंजेक्षन. उरोस्थि और रिब पिंजरे के नीचे एक इंजेक्शन साइट है, लेकिन पेट और पेट के ऊपर के लिए निशाना लगाओ. सुई तक peritoneum, डायाफ्राम पंचर नहीं सावधान घुसना पर्याप्त डालें. यह असामान्य के लिए अस्थि मज्जा का इंजेक्शन के दौरान कुछ खो नहीं है. आप पिल्ला पर अपनी पकड़ को ढीला करके नुकसान को कम करने के रूप में तुम इतने इंजेक्षन त्वचा का विस्तार करने के लिए और, तो, धीरे से सुई को हटाने की अनुमति कर सकते हैं.
Thymus के विच्छेदन
Midline के माध्यम से एक चीरा और कटौती या त्वचा फाड़ दूर रिब पिंजरे प्रकट. उरोस्थि को पकड़ो और peritoneum और डायाफ्राम के माध्यम से कटौती. रिब पिंजरे के पक्ष वक्ष गुहा प्रकट कट. thymus दिल के शीर्ष पर स्थित है. तो thymus की संरचना बनाए रखने के लिए, ऊतक आसपास के रूप में आप बाहर thymus काटना पकड़ो. पीबीएस साथ thymus कुल्ला यह विच्छेदन के दौरान बाहर सुखाने से रखने के लिए. धीरे दूर thymic कैप्सूल की सतह पर अतिरिक्त ऊतक तंग और दो lobes द्विविभाजित.
इमेजिंग के लिए ऊतक की तैयारी
पशु ऊतक चिपकने वाला गोंद thymus एक वर्ग coverslip के लिए कोई फायदा नहीं. चिपकने के एक microliter के एक अंश डाल के एक pipetteman का उपयोग करें. Thymus की अनुमानित लंबाई और चौड़ाई के लिए गोंद बिखरा हुआ है. Coverslip के खिलाफ स्थिर thymus और यह जगह में खींचें.
दो - फोटॉन इमेजिंग
ऊतक DMEM में phenol के लाल है कि 95% ऑक्सीजन और 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ perfused है और 37 को गरम डिग्री सेल्सियस के बिना डूबे हुए है दो photon उत्तेजना स्पेक्ट्रा - भौतिकी MaiTai 900nm करने के लिए देखते लेजर, और CFP, GFP, YFP और टेक्सास लाल उत्सर्जन प्रकाश अलग 495 एक का उपयोग कर, 515, 560 dichroic दर्पण और एकत्र PMT डिटेक्टरों का उपयोग का प्रयोग कर प्राप्त किया गया था.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Thymus में दो photon इमेजिंग हमें रहने वाले, बरकरार बातचीत और प्रवास है कि thymus भीतर चयन घटनाओं आबाद अंगों में जांच करने के लिए सक्षम बनाता है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
हम मैट पॉल और तकनीकी सहायता के लिए जिमी वू धन्यवाद.
References
- Kyewski, Seeding of thymic microenvironments defined by distinct thymocyte-stromal cell interactions is developmentally controlled. J Exp Med. 166, 520-538 (1987).
- Ladi, E., Yin, X., Chtanova, T., Robey, E. A. Thymic microenvironments for T cell differentiation and selection. Nat Immunol. 7, 338-343 (2006).
- Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. Directed Migration of Positively Selected Thymocytes Visualized in Real Time. PLoS Biol. 3, (2005).
