Detta protokoll presenterar ett optimerat bioanalyssystem för fristående blad för att utvärdera effektiviteten av entomopatogena svampar (EPF) mot senapsbladlusen (Lipaphis erysimi (Kalt.)), en partenogenetisk insekt. Metoden beskriver datainsamlingsprocessen under petriskålsexperiment, vilket gör det möjligt för forskare att konsekvent mäta EPF:s virulens mot senapsbladlöss och andra partenogenetiska insekter.
Senapsbladlusen (L. erysimi) är en skadegörare som angriper olika korsblommiga grödor och överför växtvirus. För att uppnå miljövänlig skadedjursbekämpning är entomopatogena svampar (EPF) potentiella mikrobiella bekämpningsmedel för att bekämpa denna skadegörare. Därför är virulensscreening av EPF-isolat under petriskålförhållanden nödvändig före fältapplicering. Senapsbladlusen är dock en partenogenetisk insekt, vilket gör det svårt att registrera data under petriskålsexperiment. Ett modifierat system för bioanalyser av fristående blad utvecklades för att ta itu med detta problem, med hjälp av en mikrospruta för att inokulera konidier på bladlöss och förhindra drunkning genom att underlätta lufttorkning efter sporsuspension. Systemet bibehöll hög relativ luftfuktighet under hela observationsperioden, och bladskivan förblev fräsch i över tio dagar, vilket möjliggjorde partenogenetisk reproduktion av bladlössen. För att förhindra ansamling av avkommor implementerades en process med daglig borttagning med hjälp av en målarpensel. Detta protokoll visar ett stabilt system för att utvärdera virulensen hos EPF-isolat mot senapsbladlöss eller andra bladlöss, vilket gör det möjligt att välja potentiella isolat för bladlusbekämpning.
Senapsbladlusen (L. erysimi) är en ökänd skadegörare som angriper en mängd olika korsblommiga grödor och orsakar betydande ekonomiska förluster1. Flera systematiska insekticider har rekommenderats för att bekämpa bladlusangrepp, men den frekventa användningen av dessa insekticider ger upphov till farhågor om resistens mot bekämpningsmedel 2,3. När det gäller miljövänligt växtskydd kan entomopatogena svampar därför fungera som en lämplig alternativ bekämpningsstrategi. EPF är en insektspatogen med förmågan att infektera värdar genom att tränga in i deras nagelband, vilket gör den till ett potent medel för att bekämpa bladlöss och andra växtsugande insekter4. Dessutom har EPF visat sig vara en genomförbar och hållbar teknik för skadedjursbekämpning, som erbjuder fördelar som antagonism mot växtpatogener och främjande av växttillväxt5.
EPF kan erhållas genom bete med insektsjord eller isoleras från insektskadaver i fält 6,7. Innan ytterligare användning av svampisolat är det dock nödvändigt att göra en screening av patogeniciteten. Flera studier har genomförts om EPF:s effektivitet mot bladlöss, som är betydande skadegörare på grödor som kan orsaka allvarliga skador 8,9. Senapsbladlöss, bland olika arter av bladlöss, har testats för känslighet för flera stammar av Beauveria spp., Metarhizium spp., Lecanicillium spp., Paecilomyces spp., och till och med Alternaria, som främst är känd som en saprofytisk och växtpatogen svamp men har visat vissa dödliga effekter mot senapsbladlöss10,11,12.
För att utvärdera EPF:s effektivitet mot bladlöss under laboratorieförhållanden kan bioassays delas in i två huvuddelar: inokuleringskammaren och svampinokulering. Det nuvarande protokollet beskriver konstruktionen av en inokuleringskammare, där bladlöss kan underhållas med hjälp av olika metoder, t.ex. ett utskuret blad med ett bladskaft inlindat i fuktig bomull, en utskuren bladskiva med en petriskål fodrad med fuktat filterpapper, direkt underhåll på krukväxter eller en utskuren bladskiva inbäddad i vattenagar i en petriskål eller behållare10. 11,13. Vanliga metoder för svampinokulering inkluderar konidisprutning, bladlusnedsänkning i en konidisuspension, bladdoppning i en konidisuspension och ympning av växtendofyter11,14,15,16. Även om det finns olika inokuleringsmetoder bör bioassayerna simulera appliceringsförhållanden i fält. Till exempel, i fallet med bladdoppningsmetoden12,17, kan effektiviteten av EPF utvärderas, men eftersom bladlössen angriper de svampladdade bladen, utsätts bladlössens ryggsida, som är en föredragen penetrationsplats, vanligtvis inte för svampen.
För att utvärdera den afhidicida effekten av EPF under laboratorieförhållanden föreslår detta protokoll att man använder metoden med fristående blad som beskrivs av Yokomi och Gottwald18 med vissa modifieringar, följt av konidiinokulering med hjälp av en mikrospruta. Denna metod bibehåller cirka 100 % luftfuktighet i bioanalyskammaren i minst sju dagar utan att kräva ytterligare påfyllning av vatten18,19. Att begränsa bladlöss till en yta säkerställer dessutom att de utsätts för konidisprutning och underlättar observationer20. Bladlöss kan dock fastna i den exponerade agarytan när de rör sig i inokuleringskammaren. Dessutom kan det vara svårt att registrera data i petriskålsförsöket med senapsbladlöss, som är partenogenetiska insekter, på grund av deras snabba utveckling och reproduktion. Det är svårt att skilja mellan vaccinerade vuxna individer och deras avkomma utan avlägsnande. Detaljerna om hur man går vidare med detta steg nämns sällan, och vissa inkonsekventa faktorer, såsom bladförbrukningsyta, måste optimeras.
Detta protokoll visar ett stabilt system för screening av virulensen hos EPF-isolat mot senapsbladlöss, vilket gör det möjligt att välja ut potentiella isolat mot olika bladlusarter från ett omfattande EPF-bibliotek. Fältinsamlade bladlöss kan identifieras, och en tillräcklig laboratoriepopulation av senapsbladlöss kan etableras för att utvärdera den afhidicida effekten av olika svampisolat med hjälp av en enkel och genomförbar metod med konsekventa resultat. Bladlöss har utvecklat flera evolutionära mekanismer som svar på intensiva och upprepade antropogena påfrestningar i jordbruksekosystem, vilket innebär utmaningar för livsmedelsförsörjningen9. Därför kan denna beskrivna metod utvidgas till att utvärdera potentiella EPF-isolat mot olika bladlusarter.
Korsblommiga växter, en grupp grönsaker, angrips ofta av flera bladlusarter, inklusive senapsbladlus (L. erysimi) och kålbladlus (Brevicoryne brassicae)26. Båda arterna har rapporterats i Taiwan27, och det är möjligt för dem att samexistera på insamlingsplatsen. För att särskilja närbesläktade bladlusarter användes i denna studie en molekylär identifieringsteknik med hjälp av en multiplex primer set21. Genom att desig…
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning stöddes av 109-2313-B-005 -048 -MY3 från ministeriet för vetenskap och teknik (MOST).
10 μL Inoculating Loop | NEST Scientific | 718201 | |
100 bp DNA Ladder III | Geneaid | DL007 | |
2x SuperRed PCR Master Mix | Biotools | TE-SR01 | |
50 mL centrifuge tube | Bioman Scientific | ET5050-12 | |
6 cm Petri dish | Alpha Plus Scientific | 16021 | |
6 mm insect aspirator | MegaView Science | BA6001 | |
70 mm filter paper NO.1 | Toyo Roshi Kaisha | ||
70% ethanol | |||
9 cm Petri dish | Alpha Plus Scientific | 16001 | |
Agar | Bioman Scientific | AGR001.1 | Microbiology grade |
Agarose | Bioman Scientific | PB1200 | |
BioGreen Safe DNA Gel Buffer | Bioman Scientific | SDB001T | |
Chromas | Technelysium | ||
GeneDoc | |||
GenepHlow Gel/PCR Kit | Geneaid | DFH300 | https://www.geneaid.com/data/files/1605861013102532959.pdf |
Gene-Spin Genomic DNA Isolation Kit | Protech Technology | PT-GD112-V3 | http://www.protech-bio.com/UserFiles/file/Gene-Spin%20Genomic%20DNA%20Kit.pdf |
Hemocytometer | Paul Marienfeld | 640030 | |
Komatsuna leaves (Brassica rapa var. perviridis) | Tai Cheng Farm | 1-010-300410 | |
Microsprayer | |||
MiniAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A37834 | |
Mustard aphid (Lipaphis erysimi) | |||
Painting brush | Tian Cheng brush company | 4716608400352 | |
Parafilm M | Bemis | PM-996 | |
Pellet pestle | Bioman Scientific | GT100R | |
Sabouraud Dextrose Broth | HiMedia | MH033-500G | |
SPSS Statistics | IBM | ||
TAE buffer 50x | Bioman Scientific | TAE501000 | |
Tween 80 | PanReac AppliChem | 142050.1661 |