Préparation ex vivo d’une tranche de moelle épinière pour l’enregistrement d’un patch-clamp de cellules entières dans les motoneurones lors d’une stimulation de la moelle épinière
Summary
Ce protocole décrit une méthode utilisant un patch-clamp pour étudier les réponses électriques des motoneurones à la stimulation de la moelle épinière (SCS) avec une résolution spatio-temporelle élevée, ce qui peut aider les chercheurs à améliorer leurs compétences en séparant la moelle épinière et en maintenant la viabilité cellulaire simultanément.
Abstract
La stimulation de la moelle épinière (SCS) peut restaurer efficacement la fonction locomotrice après une lésion de la moelle épinière (LME). Étant donné que les motoneurones sont l’unité finale pour exécuter les comportements sensori-moteurs, l’étude directe des réponses électriques des motoneurones avec SCS peut nous aider à comprendre la logique sous-jacente de la modulation motrice spinale. Pour enregistrer simultanément diverses caractéristiques de stimulus et réponses cellulaires, un patch-clamp est une bonne méthode pour étudier les caractéristiques électrophysiologiques à l’échelle d’une seule cellule. Cependant, il existe encore des difficultés complexes pour atteindre cet objectif, notamment le maintien de la viabilité cellulaire, la séparation rapide de la moelle épinière de la structure osseuse et l’utilisation du SCS pour induire avec succès des potentiels d’action. Ici, nous présentons un protocole détaillé utilisant patch-clamp pour étudier les réponses électriques des motoneurones à la SCS avec une résolution spatio-temporelle élevée, ce qui peut aider les chercheurs à améliorer leurs compétences dans la séparation de la moelle épinière et le maintien de la viabilité cellulaire en même temps pour étudier en douceur le mécanisme électrique de la SCS sur le motoneurone et éviter les essais et les erreurs inutiles.
Introduction
La stimulation de la moelle épinière (SCS) peut restaurer efficacement la fonction locomotrice après une lésion de la moelle épinière (LME). Andreas Rowald et al. ont rapporté que le SCS permet la fonction locomotrice et abdominale des membres inférieurs en un seul jour1. L’exploration du mécanisme biologique de la SCS pour la récupération locomotrice est un domaine de recherche critique et en vogue pour le développement d’une stratégie SCS plus précise. Par exemple, l’équipe de Grégoire Courtine a démontré que l’interneurone excitateur Vsx2 et les neurones Hoxa10 de la moelle épinière sont les neurones clés de la réponse au SCS, et que la neuromodulation spécifique aux cellules est réalisable pour restaurer la capacité de marche du rat après une lésion SCI2. Cependant, peu d’études se concentrent sur le mécanisme électrique du SCS à l’échelle d’une seule cellule. Bien qu’il soit bien connu que le stimulus à courant continu supraseuil peut provoquer les potentiels d’action (PA) dans l’expérience classique du calmar 3,4,5, la façon dont la stimulation électrique alternée pulsée, telle que SCS, affecte la génération du signal moteur n’est pas encore claire.
Compte tenu de la complexité des circuits neuronaux intraspinaux, une sélection appropriée pour la population cellulaire est importante pour étudier le mécanisme électrique du SCS. Bien que le SCS restaure la fonction motrice en activant la voie proprioceptive6, les motoneurones sont l’unité finale pour exécuter la commande motrice, dérivée de l’intégration de l’entrée afférente de l’information de proprioception7. Par conséquent, l’étude directe des caractéristiques électriques des motoneurones atteints de SCS peut nous aider à comprendre la logique sous-jacente de la modulation motrice spinale.
Comme nous le savons, le patch-clamp est la méthode de référence pour l’enregistrement électrophysiologique cellulaire avec une résolution spatio-temporelle extrêmement élevée8. Par conséquent, cette étude décrit une méthode utilisant une pince de patch pour étudier les réponses électriques des motoneurones au SCS. Par rapport au patch-clamp cérébral9, le patch-clamp de la moelle épinière est plus difficile pour les raisons suivantes : (1) La moelle épinière est protégée par le canal vertébral de petit volume, ce qui nécessite une micromanipulation très fine et un entretien rigoureux à froid glacé pour obtenir une meilleure viabilité cellulaire. (2) Parce que la moelle épinière est trop mince pour être fixée sur le plateau de coupe, elle doit être immergée dans de l’agarose à bas point de fusion et taillée après solidification.
Par conséquent, cette méthode fournit des détails techniques pour disséquer la moelle épinière et maintenir la viabilité cellulaire en même temps afin d’étudier en douceur le mécanisme électrique de la SCS sur les motoneurones et d’éviter les essais et les erreurs inutiles.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’information de mouvement modulée par SCS est finalement convergée vers les motoneurones. Par conséquent, prendre les motoneurones comme cible de recherche peut simplifier la conception de l’étude et révéler plus directement le mécanisme de neuromodulation du SCS. Pour enregistrer simultanément diverses caractéristiques de stimulus et réponses cellulaires, un patch-clamp est une bonne méthode pour étudier les caractéristiques électrophysiologiques à l’échelle d’une seule cellule. Cependant, il y …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été financée par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine pour les jeunes chercheurs (52207254 et 82301657) et le Fonds chinois pour les sciences postdoctorales (2022M711833).
Materials
| Adenosine 5’-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4034 | |
| CaCl2·2H2O | Sigma | C5080 | |
| Choline Chloride | Sigma | C7527 | |
| Cover slide tweezers | VETUS | 36A-SA | Clip a slice |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Fine scissors | RWD Life Science | S12006-10 | Cut the diaphragm |
| Fluorescence Light Source | Olympus | U-HGLGPS | |
| Fluoro-Gold | Fluorochrome | Fluorochrome | Label the motor neuron |
| Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| infrared CCD camera | Dage-MTI | IR-1000E | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| K-gluconate | Sigma | P1847 | |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414 | |
| MgSO4·7H2O | Sigma | M2773 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-200 | |
| Micropipette puller | Sutter instrument | P1000 | |
| Micro-scissors | Jinzhong | wa1020 | Laminectomy |
| Microscope for anatomy | Olympus | SZX10 | |
| Microscope for ecletrophysiology | Olympus | BX51WI | |
| Micro-toothed tweezers | RWD Life Science | F11008-09 | Lift the cut vertebral body |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigma | V900182 | |
| Na-Phosphocreatine | Sigma | P7936 | |
| Objective lens for ecletrophysiology | Olympus | LUMPLFLN60XW | working distance 2 mm |
| Osmometer | Advanced | FISKE 210 | |
| Patch-clamp amplifier | Axon | Multiclamp 700B | |
| Patch-clamp digitizer | Axon | Digidata 1550B | |
| pH meter | Mettler Toledo | FE28 | |
| Slice Anchor | Multichannel system | SHD-27H | |
| Spinal cord stimulatior | PINS | T901 | |
| Toothed tweezer | RWD Life Science | F13030-10 | Lift the xiphoid |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Wide band ultraviolet excitation filter | Olympus | U-MF2 |
References
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