Summary

Langzeitbildgebung identifizierter neuronaler Populationen mit Mikroprismen bei frei beweglichen und kopffixierten Tieren

Published: January 19, 2024
doi:

Summary

In Kombination mit einer Kopfplatte und einem optischen Design, das sowohl mit Einzel- als auch mit Zwei-Photonen-Mikroskopen kompatibel ist, bietet die Mikroprismenlinse einen erheblichen Vorteil bei der Messung neuronaler Reaktionen in einer vertikalen Säule unter verschiedenen Bedingungen, einschließlich gut kontrollierter Experimente in kopffesten Zuständen oder natürlicher Verhaltensaufgaben bei frei beweglichen Tieren.

Abstract

Mit dem Fortschritt der Multiphotonenmikroskopie und der molekularen Technologien entwickelt sich die Fluoreszenzbildgebung schnell zu einem leistungsstarken Ansatz zur Untersuchung der Struktur, Funktion und Plastizität lebender Hirngewebe. Im Vergleich zur herkömmlichen Elektrophysiologie kann die Fluoreszenzmikroskopie sowohl die neuronale Aktivität als auch die Morphologie der Zellen erfassen und so Langzeitaufnahmen der identifizierten Neuronenpopulationen mit Einzelzell- oder subzellulärer Auflösung ermöglichen. Hochauflösende Bildgebung erfordert jedoch typischerweise einen stabilen, kopffesten Aufbau, der die Bewegung des Tieres einschränkt, und die Herstellung einer flachen Oberfläche aus transparentem Glas ermöglicht die Visualisierung von Neuronen auf einer oder mehreren horizontalen Ebenen, ist jedoch bei der Untersuchung der vertikalen Prozesse, die über verschiedene Tiefen verlaufen, begrenzt. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Kombination einer Kopfplattenfixierung und eines Mikroprismas, das eine mehrschichtige und multimodale Bildgebung ermöglicht. Dieses chirurgische Präparat ermöglicht nicht nur den Zugang zur gesamten Säule des visuellen Kortex der Maus, sondern ermöglicht auch die Zwei-Photonen-Bildgebung in einer kopffesten Position und die Ein-Photonen-Bildgebung in einem frei beweglichen Paradigma. Mit diesem Ansatz kann man identifizierte Zellpopulationen über verschiedene kortikale Schichten hinweg beproben, ihre Reaktionen unter kopffesten und frei beweglichen Zuständen registrieren und die langfristigen Veränderungen über Monate hinweg verfolgen. Somit bietet diese Methode einen umfassenden Assay der Mikroschaltkreise, der einen direkten Vergleich neuronaler Aktivitäten ermöglicht, die durch gut kontrollierte Reize und unter einem natürlichen Verhaltensparadigma hervorgerufen werden.

Introduction

Das Aufkommen der In-vivo-Zwei-Photonen-Fluoreszenzbildgebung 1,2, die die neuen Technologien in optischen Systemen und genetisch veränderte Fluoreszenzindikatoren kombiniert, hat sich zu einer leistungsstarken Technik in den Neurowissenschaften entwickelt, um die komplizierte Struktur, Funktion und Plastizität im lebenden Gehirn zu untersuchen 3,4. Insbesondere bietet diese Bildgebungsmodalität einen beispiellosen Vorteil gegenüber der herkömmlichen Elektrophysiologie, indem sie sowohl die Morphologie als auch die dynamischen Aktivitäten von Neuronen erfasst und dadurch die Langzeitverfolgung identifizierter Neuronen erleichtert 5,6,7,8.

Trotz ihrer bemerkenswerten Stärken erfordert die Anwendung der hochauflösenden Fluoreszenzbildgebung oft einen statischen, am Kopf fixierten Aufbau, der die Mobilität des Tieres einschränkt 9,10,11. Darüber hinaus beschränkt die Verwendung einer transparenten Glasoberfläche zur Visualisierung von Neuronen die Beobachtungen auf eine oder mehrere horizontale Ebenen, was die Erforschung der Dynamik vertikaler Prozesse, die sich über verschiedene kortikale Tiefen erstrecken, einschränkt12.

Um diese Einschränkungen zu beheben, skizziert die vorliegende Studie ein innovatives chirurgisches Verfahren, das Kopfplattenfixierung, Mikroprisma und Miniskop integriert, um eine Bildgebungsmodalität mit mehrschichtigen und multimodalen Fähigkeiten zu schaffen. Das Mikroprisma ermöglicht die Beobachtung der vertikalen Verarbeitung entlang der kortikalen Säule 13,14,15,16, was entscheidend ist, um zu verstehen, wie Informationen verarbeitet und transformiert werden, wenn sie sich durch verschiedene Schichten des Kortex bewegen, und wie die vertikale Verarbeitung während plastischer Veränderungen verändert wird. Darüber hinaus ermöglicht es die Abbildung derselben neuronalen Populationen in einem kopffixierten Paradigma und in einer frei beweglichen Umgebung, die die vielseitigen experimentellen Einstellungen umfasst 17,18,19: Zum Beispiel ist die Kopffixierung oft für gut kontrollierte Paradigmen wie die Bewertung der Sinneswahrnehmung und stabile Aufzeichnungen unter dem 2-Photonen-Paradigma erforderlich, während die freie Bewegung eine natürlichere, flexiblere Umgebung für Verhaltensstudien bietet. Daher ist die Fähigkeit, einen direkten Vergleich in beiden Modi durchzuführen, entscheidend, um unser Verständnis der Mikroschaltungen zu verbessern, die flexible, funktionale Reaktionen ermöglichen.

Im Wesentlichen bietet die Integration von Kopfplattenfixierung, Mikroprisma und Miniskop in die Fluoreszenzbildgebung eine vielversprechende Plattform, um die Feinheiten der Struktur und Funktionalität des Gehirns zu untersuchen. Forscher können identifizierte Zellpopulationen über verschiedene Tiefen hinweg über alle kortikalen Schichten hinweg beproben, ihre Reaktionen sowohl in gut kontrollierten als auch in natürlichen Paradigmen direkt vergleichen und ihre langfristigen Veränderungen über Monate hinweg überwachen20. Dieser Ansatz bietet wertvolle Einblicke in die Interaktion und Veränderung dieser neuronalen Populationen im Laufe der Zeit unter verschiedenen experimentellen Bedingungen und bietet einen Einblick in die dynamische Natur neuronaler Schaltkreise.

Protocol

Alle Experimente wurden gemäß dem UK Animals (Scientific Procedures) Act 1986 unter persönlichen und Projektlizenzen durchgeführt, die vom britischen Innenministerium nach entsprechender Ethikprüfung genehmigt und ausgestellt wurden. adulte transgene Linien CaMKII-TTA; GCaMP6S-TRE21 wurden gezüchtet und ihre Nachkommen im Experiment verwendet. Zur Sicherheit der Experimentatoren und zur Aufrechterhaltung steriler Bedingungen wurden alle Verfahren unter aseptischen Bedingungen und mit vollst?…

Representative Results

Es wurde die Methode zur Durchführung einer chronischen mehrschichtigen In-vivo-Kalziumbildgebung derselben neuronalen Population über einen Zeitraum von mehreren Wochen unter Verwendung von Ein- und Zwei-Photonen-Bildgebungsmodalitäten unter frei beweglichen und kopffixierten Bedingungen gezeigt. Hier wurde die Fähigkeit demonstriert, übereinstimmende neuronale Populationen unter Ein-Photonen-Bildgebung zu identifizieren, während das Tier im Dunkeln eine offene Arena erkundete (Abbild…

Discussion

Hier haben wir die Fähigkeit gezeigt, Neuronen unter kopffixierten und frei beweglichen Bedingungen in denselben neuronalen Populationen zu beobachten und direkt zu vergleichen. Während wir die Anwendung im visuellen Kortex demonstriert haben, kann dieses Protokoll an eine Vielzahl anderer Hirnareale angepasst werden, sowohl an kortikale Areale als auch an tiefe Kerne 24,25,26,27,28 sowie an andere Datenerfassungs- und Verhaltensaufbauten<sup class="…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Frau Charu Reddy und Professor Matteo Carandini (Cortex Lab) für ihre Ratschläge zum chirurgischen Protokoll und zum Austausch transgener Mausstämme. Wir danken Dr. Norbert Hogrefe (Inscopix) für seine Anleitung und Unterstützung bei der Entwicklung der Operation. Wir danken Frau Andreea Aldea (Sun Lab) für ihre Unterstützung bei der chirurgischen Einrichtung und Datenverarbeitung. Diese Arbeit wurde von der Moorfields Eye Charity unterstützt.

Materials

0.9% Sodium Chloride solution for infusion (Vetivex 11) 250ml Dechra 20091607 Saline for hydration and drug reconsitution
18004-1 Trephine 1.8mm diameter bur FST 18004-18 Drill bit
1ml syringe Terumo MDSS01SE 1ml syringe
23G x 5/8 inch 6% LUER needle Terumo NN-2316R 23G needle
71000 Automated stereotaxic apparatus w/ built-in software RWD RWD
Absorbable Haemostatic Gelatin Sponge (10x10x10mm) Surgispon SSP-101010 gel-foam
Alcohol pads 70% isopropyl alcohol Braun 9160612 Alcohol pads
Aluminium foil Any retailer Foil to cover eyes during surgery
Articifical Cerebrospinal Fluid  Tocris Bioscience a Bio-Techne Brand 3525/25ML ACSF
Automated microinjection pump WPI 8091
Betadine solution (10% iodinated Povidone) 500ml Videne/Ecolab 3030440 Betadine
Bruker Ultime 2Pplus (customised) Bruker Two-photon imaging system 
Cardiff Aldasorber Vet-Tech AN006 Anaesthesia absorber
CFI S Plan Fluor ELWD ADM 20XC Nikon MRH48230 20x objective lens
Compact Anaesthesia system – single gas – isoflurane K/F, with oxygen concentrator model: ZY-5AC and scavenging unit Vet-Tech AN001 Compact anaesthesia system 
Contec Prochlor  Aston Pharma AP2111L1 Disinfectant (hypochlorous acid)
Dexamethasone Sodium Phosphate Injection, USP, 4mg/ml, NDC: 0641-6145-25 Hikma Covetrus:70789 Dexamethasone
Dissecting Knife, cutting edge 4mm, thickness 0.5mm, stainless steel Fine Science Tools 10055-12 Knife for incisino of cortex
Dual-Sided, Non-Puncture Mouse & Neonatal Rat Ear Bars Stoelting 51649 Ear bar
Dummy microscope Inscopix Dummy microscope To help with implantation
Ethanol (100%)  VWR 40-1712-25 Used to make 70% ethanol 
Fisherbrand Nitrile Indigo Disposable Gloves PPE Cat III FischerScientific 17182182 Gloves
Homeothermic Monitor 50-7222-F Harvard Apparatus 50-7222-F Homeothermic monitoring system/heating pad
Image processing software ImageJ Image processing software
Inscopix Data Processing Software (IDPS) Inscopix One-photon calcium imaging processing software
Insight Duals-232, S/N 2043 InSight Insight Spectra X3 Two-photon imaging laser
IsoFlo 250ml 100% w/w inhalation Zoetis WM 42058/4195 Isoflurane
Kwik-Sil Low Toxicity Silicone Adhesive World Precision Intruments (WPI) KWIK-SIL Silicone adhesive
MICROMOT mains adapter NG 2/S, w/ Drill unit 60/E PROXXON NO 28 515 Handheld drill
nVoke Integrated Imaging and Optogenetics System package Inscopix One-photon Imaging system and software
ProView Implant Kit Inscopix ProView Implant Kit Dummy microscope, stereotaxic arm and attachment 
ProView Prism Probe Inscopix 1050-002203 Microprism lens
Rimadyl (50mg/ml) Zoetis VM 42058/4123 Carprofen 
Stereotaxis Microscope on Articulated arm with table clamp WPI PZMTIII-AAC  Microscope
Super-Bond Universal kit, SUN Medical Prestige-Dental K058E Adhesive cement
Two-photon calcium image software Suite2P Two-photon calcium imaging processing software
Vapouriser Vet-Tech Isoflurane vapouriser
Xailin Lubricating Eye Ointment 5g Xailin-Night MLG/28/1551 Ophthalmic ointment 

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Cite This Article
Burrows, R., Ma, C., Sun, Y. J. Long-Term Imaging of Identified Neural Populations using Microprisms in Freely Moving and Head-Fixed Animals. J. Vis. Exp. (203), e65387, doi:10.3791/65387 (2024).

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