자유롭게 움직이고 머리가 고정된 동물에서 마이크로프리즘을 사용하여 식별된 신경 집단의 장기 이미징
Summary
헤드 플레이트 및 단일 광자 및 이광자 현미경과 호환되는 광학 설계와 통합될 경우, 마이크로프리즘 렌즈는 머리가 고정된 상태에서의 잘 제어된 실험이나 자유롭게 움직이는 동물의 자연스러운 행동 작업을 포함하여 다양한 조건에서 수직 컬럼의 신경 반응을 측정하는 데 상당한 이점을 제공합니다.
Abstract
다광자 현미경 및 분자 기술의 발전으로 형광 이미징은 빠르게 성장하여 살아있는 뇌 조직의 구조, 기능 및 가소성을 연구하기 위한 강력한 접근 방식이 되고 있습니다. 기존의 전기생리학과 비교했을 때, 형광 현미경은 세포의 형태뿐만 아니라 신경 활동도 포착할 수 있어 단세포 또는 세포 내 분해능으로 식별된 뉴런 집단을 장기간 기록할 수 있습니다. 그러나 고해상도 이미징은 일반적으로 동물의 움직임을 제한하는 안정적인 머리 고정 설정이 필요하며, 투명 유리의 평평한 표면을 준비하면 하나 이상의 수평면에서 뉴런을 시각화할 수 있지만 다양한 깊이에서 실행되는 수직 프로세스를 연구하는 데는 제한적입니다. 여기에서는 헤드 플레이트 고정과 다층 및 다중 모드 이미징을 제공하는 마이크로 프리즘을 결합하는 절차를 설명합니다. 이 수술 준비는 생쥐 시각 피질의 전체 기둥에 접근할 수 있을 뿐만 아니라 머리 고정 위치에서 2광자 이미징과 자유롭게 움직이는 패러다임에서 1광자 이미징을 가능하게 합니다. 이 접근법을 사용하면 다양한 피질 층에서 식별된 세포 집단을 샘플링하고, 머리가 고정되고 자유롭게 움직이는 상태에서 반응을 등록하고, 수개월에 걸친 장기적인 변화를 추적할 수 있습니다. 따라서 이 방법은 미세 회로에 대한 포괄적인 분석을 제공하여 잘 제어된 자극과 자연스러운 행동 패러다임에 의해 유발되는 신경 활동을 직접 비교할 수 있습니다.
Introduction
광학 시스템과 유전자 변형 형광 지표의 새로운 기술을 결합한 생체 내 이광자 형광 이미징(in vivo two-photon fluorescent imaging)1,2의 출현은 살아있는 뇌의 복잡한 구조, 기능 및 가소성을 조사하기 위한 신경 과학의 강력한 기술로 부상했습니다 3,4. 특히, 이 이미징 방식은 뉴런의 형태와 동적 활동을 모두 포착함으로써 기존 전기생리학에 비해 비교할 수 없는 이점을 제공하여 식별된 뉴런의 장기 추적을 용이하게 합니다 5,6,7,8.
주목할 만한 장점에도 불구하고, 고해상도 형광 이미징을 적용하려면 동물의 이동성을 제한하는 정적인 머리 고정 설정이 필요한 경우가 많습니다 9,10,11. 또한, 뉴런을 시각화하기 위해 투명한 유리 표면을 사용하면 관찰이 하나 이상의 수평면으로 제한되어, 상이한 피질 깊이(12)에 걸쳐 확장되는 수직 과정의 역학에 대한 탐색이 제한된다.
이러한 한계를 해결하기 위해 본 연구는 헤드 플레이트 고정, 마이크로 프리즘 및 미니스코프를 통합하여 다층 및 다중 모드 기능을 갖춘 이미징 양식을 만드는 혁신적인 수술 절차를 간략하게 설명합니다. 마이크로프리즘은 피질기둥(13,14,15,16)을 따라 수직처리를 관찰할 수 있게 해주는데, 이는 정보가 피질의 여러 층을 통과할 때 어떻게 처리되고 변형되는지, 그리고 소성 변화 동안 수직 처리가 어떻게 변경되는지를 이해하는 데 매우 중요하다. 더욱이, 다양한 실험 설정(17,18,19)을 포함하는 머리 고정 패러다임과 자유롭게 움직이는 환경에서 동일한 신경 집단의 이미징을 허용합니다: 예를 들어, 감각 지각 평가 및 2광자 패러다임 하에서 안정적인 기록과 같은 잘 제어된 패러다임에는 머리 고정이 종종 필요한 반면, 자유롭게 움직이는 것은 행동 연구를 위한 보다 자연스럽고 유연한 환경을 제공합니다. 따라서 두 모드에서 직접 비교를 수행할 수 있는 능력은 유연하고 기능적인 응답을 가능하게 하는 미세 회로에 대한 이해를 높이는 데 매우 중요합니다.
본질적으로, 형광 이미징에서 헤드 플레이트 고정, 마이크로 프리즘 및 미니스코프의 통합은 뇌 구조와 기능의 복잡성을 조사할 수 있는 유망한 플랫폼을 제공합니다. 연구원들은 모든 피질층에 걸쳐 다양한 깊이에서 식별된 세포 집단을 샘플링하고, 잘 통제된 패러다임과 자연 패러다임 모두에서 반응을 직접 비교하고,20개월 동안 장기적인 변화를 모니터링할 수 있습니다. 이 접근 방식은 이러한 신경 집단이 다양한 실험 조건에서 시간이 지남에 따라 어떻게 상호 작용하고 변화하는지에 대한 귀중한 통찰력을 제공하여 신경 회로의 동적 특성에 대한 창을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서 우리는 동일한 신경 집단에서 머리가 고정되고 자유롭게 움직이는 조건에서 뉴런을 관찰하고 직접 비교할 수 있는 능력을 보여주었습니다. 우리가 시각 피질에서 응용을 시연하는 동안, 이 프로토콜은 피질 영역과 심부 핵 24,25,26,27,28 뿐만 아니라 다른 데이터 수집 및 행동 설정<sup …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
수술 프로토콜과 형질전환 마우스 균주 공유에 대한 조언을 해주신 Ms. Charu Reddy와 Matteo Carandini 교수(Cortex Lab)에게 감사드립니다. 수술 개발 전반에 걸친 지도와 도움을 주신 Norbert Hogrefe 박사(Inscopix)에게 감사드립니다. 수술 설정 및 데이터 처리에 도움을 주신 Ms Andreea Aldea (Sun Lab)에게 감사드립니다. 이 작업은 Moorfields Eye Charity의 지원을 받았습니다.
Materials
| 0.9% Sodium Chloride solution for infusion (Vetivex 11) 250ml | Dechra | 20091607 | Saline for hydration and drug reconsitution |
| 18004-1 Trephine 1.8mm diameter bur | FST | 18004-18 | Drill bit |
| 1ml syringe | Terumo | MDSS01SE | 1ml syringe |
| 23G x 5/8 inch 6% LUER needle | Terumo | NN-2316R | 23G needle |
| 71000 Automated stereotaxic apparatus w/ built-in software | RWD | – | RWD |
| Absorbable Haemostatic Gelatin Sponge (10x10x10mm) | Surgispon | SSP-101010 | gel-foam |
| Alcohol pads 70% isopropyl alcohol | Braun | 9160612 | Alcohol pads |
| Aluminium foil | Any retailer | – | Foil to cover eyes during surgery |
| Articifical Cerebrospinal Fluid | Tocris Bioscience a Bio-Techne Brand | 3525/25ML | ACSF |
| Automated microinjection pump | WPI | 8091 | |
| Betadine solution (10% iodinated Povidone) 500ml | Videne/Ecolab | 3030440 | Betadine |
| Bruker Ultime 2Pplus (customised) | Bruker | – | Two-photon imaging system |
| Cardiff Aldasorber | Vet-Tech | AN006 | Anaesthesia absorber |
| CFI S Plan Fluor ELWD ADM 20XC | Nikon | MRH48230 | 20x objective lens |
| Compact Anaesthesia system – single gas – isoflurane K/F, with oxygen concentrator model: ZY-5AC and scavenging unit | Vet-Tech | AN001 | Compact anaesthesia system |
| Contec Prochlor | Aston Pharma | AP2111L1 | Disinfectant (hypochlorous acid) |
| Dexamethasone Sodium Phosphate Injection, USP, 4mg/ml, NDC: 0641-6145-25 | Hikma | Covetrus:70789 | Dexamethasone |
| Dissecting Knife, cutting edge 4mm, thickness 0.5mm, stainless steel | Fine Science Tools | 10055-12 | Knife for incisino of cortex |
| Dual-Sided, Non-Puncture Mouse & Neonatal Rat Ear Bars | Stoelting | 51649 | Ear bar |
| Dummy microscope | Inscopix | Dummy microscope | To help with implantation |
| Ethanol (100%) | VWR | 40-1712-25 | Used to make 70% ethanol |
| Fisherbrand Nitrile Indigo Disposable Gloves PPE Cat III | FischerScientific | 17182182 | Gloves |
| Homeothermic Monitor 50-7222-F | Harvard Apparatus | 50-7222-F | Homeothermic monitoring system/heating pad |
| Image processing software | ImageJ | – | Image processing software |
| Inscopix Data Processing Software (IDPS) | Inscopix | – | One-photon calcium imaging processing software |
| Insight Duals-232, S/N 2043 | InSight | Insight Spectra X3 | Two-photon imaging laser |
| IsoFlo 250ml 100% w/w inhalation | Zoetis | WM 42058/4195 | Isoflurane |
| Kwik-Sil Low Toxicity Silicone Adhesive | World Precision Intruments (WPI) | KWIK-SIL | Silicone adhesive |
| MICROMOT mains adapter NG 2/S, w/ Drill unit 60/E | PROXXON | NO 28 515 | Handheld drill |
| nVoke Integrated Imaging and Optogenetics System package | Inscopix | – | One-photon Imaging system and software |
| ProView Implant Kit | Inscopix | ProView Implant Kit | Dummy microscope, stereotaxic arm and attachment |
| ProView Prism Probe | Inscopix | 1050-002203 | Microprism lens |
| Rimadyl (50mg/ml) | Zoetis | VM 42058/4123 | Carprofen |
| Stereotaxis Microscope on Articulated arm with table clamp | WPI | PZMTIII-AAC | Microscope |
| Super-Bond Universal kit, SUN Medical | Prestige-Dental | K058E | Adhesive cement |
| Two-photon calcium image software | Suite2P | – | Two-photon calcium imaging processing software |
| Vapouriser | Vet-Tech | – | Isoflurane vapouriser |
| Xailin Lubricating Eye Ointment 5g | Xailin-Night | MLG/28/1551 | Ophthalmic ointment |
References
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