Summary

Langtidsavbildning av identifiserte nevrale populasjoner ved bruk av mikroprismer i fritt bevegelige og hodefikserte dyr

Published: January 19, 2024
doi:

Summary

Når den integreres med en hodeplate og en optisk design som er kompatibel med både enkelt- og to-foton mikroskoper, gir mikroprismelinsen en betydelig fordel ved måling av nevrale responser i en vertikal kolonne under forskjellige forhold, inkludert velkontrollerte eksperimenter i hodefaste tilstander eller naturlige atferdsoppgaver i fritt bevegelige dyr.

Abstract

Med utviklingen av multi-foton mikroskopi og molekylær teknologi, vokser fluorescensavbildning raskt til å bli en kraftig tilnærming for å studere strukturen, funksjonen og plastisiteten til levende hjernevev. Sammenlignet med konvensjonell elektrofysiologi kan fluorescensmikroskopi fange nevral aktivitet så vel som morfologien til cellene, noe som muliggjør langsiktige opptak av de identifiserte nevronpopulasjonene ved enkeltcelle- eller subcellulær oppløsning. Imidlertid krever høyoppløselig avbildning vanligvis et stabilt, hodefast oppsett som begrenser dyrets bevegelse, og fremstillingen av en flat overflate av gjennomsiktig glass tillater visualisering av nevroner på ett eller flere horisontale plan, men er begrenset til å studere de vertikale prosessene som går over forskjellige dybder. Her beskriver vi en prosedyre for å kombinere en hodeplatefiksering og et mikroprisme som gir flerlags og multimodal avbildning. Dette kirurgiske preparatet gir ikke bare tilgang til hele kolonnen i musens visuelle cortex, men tillater to-foton avbildning i en hodefast stilling og en-foton avbildning i et fritt bevegelig paradigme. Ved hjelp av denne tilnærmingen kan man prøve identifiserte cellepopulasjoner over forskjellige kortikale lag, registrere deres svar under hodefaste og fritt bevegelige tilstander, og spore de langsiktige endringene over måneder. Dermed gir denne metoden en omfattende analyse av mikrokretsene, noe som muliggjør direkte sammenligning av nevrale aktiviteter fremkalt av velkontrollerte stimuli og under et naturlig atferdsparadigme.

Introduction

Fremkomsten av in vivo to-foton fluorescerende avbildning 1,2, som kombinerer de nye teknologiene i optiske systemer og genetisk modifiserte fluorescensindikatorer, har dukket opp som en kraftig teknikk innen nevrovitenskap for å undersøke den intrikate strukturen, funksjonen og plastisiteten i den levende hjernen 3,4. Spesielt gir denne bildemodaliteten en enestående fordel i forhold til tradisjonell elektrofysiologi ved å fange både morfologi og dynamiske aktiviteter av nevroner, og dermed legge til rette for langsiktig sporing av identifiserte nevroner 5,6,7,8.

Til tross for sine bemerkelsesverdige styrker, krever anvendelsen av høyoppløselig fluorescensavbildning ofte et statisk, hodefast oppsett som begrenser dyrets mobilitet 9,10,11. I tillegg begrenser bruken av en gjennomsiktig glassoverflate for visualisering av nevroner observasjoner til ett eller flere horisontale plan, noe som begrenser utforskningen av dynamikken i vertikale prosesser som strekker seg over forskjellige kortikale dybder12.

For å adressere disse begrensningene, skisserer denne studien en innovativ kirurgisk prosedyre som integrerer hodeplatefiksering, mikroprisme og miniskop for å skape en avbildningsmodalitet med flerlags og multimodale evner. Mikroprismet tillater observasjon av den vertikale behandlingen langs den kortikale kolonnen 13,14,15,16, noe som er avgjørende for å forstå hvordan informasjon behandles og transformeres når den beveger seg gjennom forskjellige lag i cortex og hvordan den vertikale behandlingen endres under plastendringer. Videre tillater det avbildning av de samme nevrale populasjonene i et hodefiksert paradigme og i en fritt bevegelig setting, som omfatter de allsidige eksperimentelle innstillingene 17,18,19: for eksempel er hodefiksering ofte nødvendig for velkontrollerte paradigmer som sensorisk persepsjonsvurdering og stabile opptak under 2-foton paradigme, mens fritt bevegelige gir et mer naturlig, fleksibelt miljø for atferdsstudier. Derfor er evnen til å utføre en direkte sammenligning i begge modusene avgjørende for å fremme vår forståelse av mikrokretsene som muliggjør fleksible, funksjonelle responser.

I hovedsak tilbyr integreringen av hodeplatefiksering, mikroprisme og miniskop i fluorescensavbildning en lovende plattform for å undersøke vanskelighetene med hjernens struktur og funksjonalitet. Forskere kan prøve identifiserte cellepopulasjoner over ulike dybder som spenner over alle kortikale lag, direkte sammenligne deres svar i både velkontrollerte og naturlige paradigmer, og overvåke deres langsiktige endringer over måneder20. Denne tilnærmingen gir verdifull innsikt i hvordan disse nevrale populasjonene samhandler og endres over tid under forskjellige eksperimentelle forhold, og gir et vindu inn i nevrale kretsers dynamiske natur.

Protocol

Alle eksperimenter ble utført i henhold til UK Animals (Scientific Procedures) Act 1986 under personlige lisenser og prosjektlisenser godkjent og utstedt av UK Home Office etter passende etisk gjennomgang. Voksne transgene linjer CaMKII-TTA; GCaMP6S-TRE21 ble avlet og deres avkom brukt i forsøket. For eksperimentenes sikkerhet og vedlikehold av sterile forhold ble alle prosedyrene utført under aseptiske forhold og med fullt personlig verneutstyr. 1. Preoperativ…

Representative Results

Metoden for å gjennomføre kronisk flerlags in vivo kalsiumavbildning av den samme nevronpopulasjonen over en periode på flere uker, ved bruk av både en- og to-foton bildebehandlingsmodaliteter, under fritt bevegelige og hodefaste forhold har blitt vist. Her har evnen til å identifisere matchende nevronpopulasjoner under en-foton avbildning mens dyret utforsket en åpen arena i mørket blitt demonstrert (figur 7A). Kalsiumspor ble ekstrahert fra de identifiserte nevronene og z-s…

Discussion

Her har vi vist evnen til å observere og direkte sammenligne nevroner i hodefaste og fritt bevegelige forhold i de samme nevrale populasjonene. Mens vi demonstrerte applikasjonen i den visuelle cortexen, kan denne protokollen tilpasses en rekke andre hjerneområder, både kortikale områder og dype kjerner 24,25,26,27,28, samt annen datainnsamling og atferdsoppsett

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Charu Reddy og professor Matteo Carandini (Cortex Lab) for deres råd om kirurgisk protokoll og deling av transgen musestamme. Vi takker Dr. Norbert Hogrefe (Inscopix) for hans veiledning og hjelp gjennom utviklingen av operasjonen. Vi takker Andreea Aldea (Sun Lab) for hennes hjelp med kirurgisk oppsett og databehandling. Dette arbeidet ble støttet av Moorfields Eye Charity.

Materials

0.9% Sodium Chloride solution for infusion (Vetivex 11) 250ml Dechra 20091607 Saline for hydration and drug reconsitution
18004-1 Trephine 1.8mm diameter bur FST 18004-18 Drill bit
1ml syringe Terumo MDSS01SE 1ml syringe
23G x 5/8 inch 6% LUER needle Terumo NN-2316R 23G needle
71000 Automated stereotaxic apparatus w/ built-in software RWD RWD
Absorbable Haemostatic Gelatin Sponge (10x10x10mm) Surgispon SSP-101010 gel-foam
Alcohol pads 70% isopropyl alcohol Braun 9160612 Alcohol pads
Aluminium foil Any retailer Foil to cover eyes during surgery
Articifical Cerebrospinal Fluid  Tocris Bioscience a Bio-Techne Brand 3525/25ML ACSF
Automated microinjection pump WPI 8091
Betadine solution (10% iodinated Povidone) 500ml Videne/Ecolab 3030440 Betadine
Bruker Ultime 2Pplus (customised) Bruker Two-photon imaging system 
Cardiff Aldasorber Vet-Tech AN006 Anaesthesia absorber
CFI S Plan Fluor ELWD ADM 20XC Nikon MRH48230 20x objective lens
Compact Anaesthesia system – single gas – isoflurane K/F, with oxygen concentrator model: ZY-5AC and scavenging unit Vet-Tech AN001 Compact anaesthesia system 
Contec Prochlor  Aston Pharma AP2111L1 Disinfectant (hypochlorous acid)
Dexamethasone Sodium Phosphate Injection, USP, 4mg/ml, NDC: 0641-6145-25 Hikma Covetrus:70789 Dexamethasone
Dissecting Knife, cutting edge 4mm, thickness 0.5mm, stainless steel Fine Science Tools 10055-12 Knife for incisino of cortex
Dual-Sided, Non-Puncture Mouse & Neonatal Rat Ear Bars Stoelting 51649 Ear bar
Dummy microscope Inscopix Dummy microscope To help with implantation
Ethanol (100%)  VWR 40-1712-25 Used to make 70% ethanol 
Fisherbrand Nitrile Indigo Disposable Gloves PPE Cat III FischerScientific 17182182 Gloves
Homeothermic Monitor 50-7222-F Harvard Apparatus 50-7222-F Homeothermic monitoring system/heating pad
Image processing software ImageJ Image processing software
Inscopix Data Processing Software (IDPS) Inscopix One-photon calcium imaging processing software
Insight Duals-232, S/N 2043 InSight Insight Spectra X3 Two-photon imaging laser
IsoFlo 250ml 100% w/w inhalation Zoetis WM 42058/4195 Isoflurane
Kwik-Sil Low Toxicity Silicone Adhesive World Precision Intruments (WPI) KWIK-SIL Silicone adhesive
MICROMOT mains adapter NG 2/S, w/ Drill unit 60/E PROXXON NO 28 515 Handheld drill
nVoke Integrated Imaging and Optogenetics System package Inscopix One-photon Imaging system and software
ProView Implant Kit Inscopix ProView Implant Kit Dummy microscope, stereotaxic arm and attachment 
ProView Prism Probe Inscopix 1050-002203 Microprism lens
Rimadyl (50mg/ml) Zoetis VM 42058/4123 Carprofen 
Stereotaxis Microscope on Articulated arm with table clamp WPI PZMTIII-AAC  Microscope
Super-Bond Universal kit, SUN Medical Prestige-Dental K058E Adhesive cement
Two-photon calcium image software Suite2P Two-photon calcium imaging processing software
Vapouriser Vet-Tech Isoflurane vapouriser
Xailin Lubricating Eye Ointment 5g Xailin-Night MLG/28/1551 Ophthalmic ointment 

References

  1. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  2. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).
  3. Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
  4. Vaziri, A., Emiliani, V. Reshaping the optical dimension in optogenetics. Curr Opin Neurobiol. 22 (1), 128-137 (2012).
  5. Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
  6. Sun, Y. J., Sebastian Espinosa, J., Hoseini, M. S., Stryker, M. P. Experience-dependent structural plasticity at pre- and postsynaptic sites of layer 2/3 cells in developing visual cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (43), 21812-21820 (2019).
  7. Andermann, M. L., Kerlin, A. M., Reid, R. C. Chronic cellular imaging of mouse visual cortex during operant behavior and passive viewing. Front Cell Neurosci. 4, 3 (2010).
  8. Sofroniew, N. J., Flickinger, D., King, J., Svoboda, K. A large field of view two-photon mesoscope with subcellular resolution for in vivo imaging. Elife. 5, 14472 (2016).
  9. Puścian, A., Benisty, H., Higley, M. J. NMDAR-dependent emergence of behavioral representation in primary visual cortex. Cell Rep. 32 (4), 107970 (2020).
  10. Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo. imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
  11. Seaton, G., et al. Dual-component structural plasticity mediated by αCaMKII autophosphorylation on basal dendrites of cortical layer 2/3 neurones. J Neurosci. 40 (11), 2228-2245 (2020).
  12. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  13. Andermann, M. L., et al. Chronic cellular imaging of entire cortical columns in awake mice using microprisms. Neuron. 80 (4), 900-913 (2013).
  14. Chia, T. H., Levene, M. J. Microprisms for in vivo multilayer cortical imaging. J Neurophysiol. 102 (2), 1310-1314 (2009).
  15. Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: Imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (52), 18739-18744 (2014).
  16. Buxhoeveden, D. P., Casanova, M. F. The minicolumn hypothesis in neuroscience. Brain. 125, 935-951 (2002).
  17. Chen, S., et al. Miniature fluorescence microscopy for imaging brain activity in freely-behaving animals. Neurosci Bull. 36 (10), 1182-1190 (2020).
  18. Gulati, S., Cao, V. Y., Otte, S. Multi-layer cortical Ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy. J Vis Exp. (124), e55579 (2017).
  19. Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical, and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nat Protoc. 11 (3), 566-597 (2016).
  20. Guo, Z. V., et al. Procedures for behavioral experiments in head-fixed mice. PLoS One. 9 (2), 88678 (2014).
  21. Wekselblatt, J. B., Flister, E. D., Piscopo, D. M., Niell, C. M. Large-scale imaging of cortical dynamics during sensory perception and behavior. J Neurophysiol. 115 (6), 2852-2866 (2016).
  22. Pnevmatikakis, E. A., et al. Simultaneous denoising, deconvolution, and demixing of calcium imaging data. Neuron. 89 (2), 285-299 (2016).
  23. Zhou, P., et al. Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data. Elife. 7, 28728 (2018).
  24. Beckmann, L., et al. Longitudinal deep-brain imaging in mouse using visible-light optical coherence tomography through chronic microprism cranial window. Biomed Opt Express. 10 (10), 5235-5250 (2019).
  25. Wenzel, M., Hamm, J. P., Peterka, D. S., Yuste, R. Reliable and elastic propagation of cortical seizures in. Cell Rep. 19 (13), 2681-2693 (2017).
  26. Heys, J. G., Rangarajan, K. V., Dombeck, D. A. The functional micro-organization of grid cells revealed by cellular-resolution imaging. Neuron. 84 (5), 1079-1090 (2014).
  27. Barson, D., Hamodi, A. S. Simultaneous mesoscopic and two-photon imaging of neuronal activity in cortical circuits. Nat Methods. 17 (1), 107-113 (2020).
  28. Paquelet, G. E., et al. Single-cell activity and network properties of dorsal raphe nucleus serotonin neurons during emotionally salient behaviors. Neuron. 110 (16), 2664-2679 (2022).
  29. Yang, Q., et al. Transparent microelectrode arrays integrated with microprisms for electrophysiology and simultaneous two-photon imaging across cortical layers. bioRxiv. , (2022).
  30. Priestley, J. B., Bowler, J. C., Rolotti, S. V., Fusi, S., Losonczy, A. Signatures of rapid plasticity in hippocampal CA1 representations during novel experiences. Neuron. 110 (12), 1978-1992 (2022).
  31. Zong, W., et al. Miniature two-photon microscopy for enlarged field-of-view, multi-plane and long-term brain imaging. Nat Methods. 18 (1), 46-49 (2021).
  32. Engelbrecht, C. J., et al. Ultra-compact fiber-optic two-photon microscope for functional fluorescence imaging in vivo. Opt Express. 16 (8), 5556-5564 (2008).
  33. Suzuki, M., Aru, J., Larkum, M. E. Double-μ Periscope, a tool for multilayer optical recordings, optogenetic stimulations or both. Elife. 10, 72894 (2021).
  34. Stibůrek, M., et al. 110 μm thin endo-microscope for deep-brain in vivo observations of neuronal connectivity, activity and blood flow dynamics. Nat Commun. 14 (1), 1897 (2023).

Play Video

Cite This Article
Burrows, R., Ma, C., Sun, Y. J. Long-Term Imaging of Identified Neural Populations using Microprisms in Freely Moving and Head-Fixed Animals. J. Vis. Exp. (203), e65387, doi:10.3791/65387 (2024).

View Video