Når den integreres med en hodeplate og en optisk design som er kompatibel med både enkelt- og to-foton mikroskoper, gir mikroprismelinsen en betydelig fordel ved måling av nevrale responser i en vertikal kolonne under forskjellige forhold, inkludert velkontrollerte eksperimenter i hodefaste tilstander eller naturlige atferdsoppgaver i fritt bevegelige dyr.
Med utviklingen av multi-foton mikroskopi og molekylær teknologi, vokser fluorescensavbildning raskt til å bli en kraftig tilnærming for å studere strukturen, funksjonen og plastisiteten til levende hjernevev. Sammenlignet med konvensjonell elektrofysiologi kan fluorescensmikroskopi fange nevral aktivitet så vel som morfologien til cellene, noe som muliggjør langsiktige opptak av de identifiserte nevronpopulasjonene ved enkeltcelle- eller subcellulær oppløsning. Imidlertid krever høyoppløselig avbildning vanligvis et stabilt, hodefast oppsett som begrenser dyrets bevegelse, og fremstillingen av en flat overflate av gjennomsiktig glass tillater visualisering av nevroner på ett eller flere horisontale plan, men er begrenset til å studere de vertikale prosessene som går over forskjellige dybder. Her beskriver vi en prosedyre for å kombinere en hodeplatefiksering og et mikroprisme som gir flerlags og multimodal avbildning. Dette kirurgiske preparatet gir ikke bare tilgang til hele kolonnen i musens visuelle cortex, men tillater to-foton avbildning i en hodefast stilling og en-foton avbildning i et fritt bevegelig paradigme. Ved hjelp av denne tilnærmingen kan man prøve identifiserte cellepopulasjoner over forskjellige kortikale lag, registrere deres svar under hodefaste og fritt bevegelige tilstander, og spore de langsiktige endringene over måneder. Dermed gir denne metoden en omfattende analyse av mikrokretsene, noe som muliggjør direkte sammenligning av nevrale aktiviteter fremkalt av velkontrollerte stimuli og under et naturlig atferdsparadigme.
Fremkomsten av in vivo to-foton fluorescerende avbildning 1,2, som kombinerer de nye teknologiene i optiske systemer og genetisk modifiserte fluorescensindikatorer, har dukket opp som en kraftig teknikk innen nevrovitenskap for å undersøke den intrikate strukturen, funksjonen og plastisiteten i den levende hjernen 3,4. Spesielt gir denne bildemodaliteten en enestående fordel i forhold til tradisjonell elektrofysiologi ved å fange både morfologi og dynamiske aktiviteter av nevroner, og dermed legge til rette for langsiktig sporing av identifiserte nevroner 5,6,7,8.
Til tross for sine bemerkelsesverdige styrker, krever anvendelsen av høyoppløselig fluorescensavbildning ofte et statisk, hodefast oppsett som begrenser dyrets mobilitet 9,10,11. I tillegg begrenser bruken av en gjennomsiktig glassoverflate for visualisering av nevroner observasjoner til ett eller flere horisontale plan, noe som begrenser utforskningen av dynamikken i vertikale prosesser som strekker seg over forskjellige kortikale dybder12.
For å adressere disse begrensningene, skisserer denne studien en innovativ kirurgisk prosedyre som integrerer hodeplatefiksering, mikroprisme og miniskop for å skape en avbildningsmodalitet med flerlags og multimodale evner. Mikroprismet tillater observasjon av den vertikale behandlingen langs den kortikale kolonnen 13,14,15,16, noe som er avgjørende for å forstå hvordan informasjon behandles og transformeres når den beveger seg gjennom forskjellige lag i cortex og hvordan den vertikale behandlingen endres under plastendringer. Videre tillater det avbildning av de samme nevrale populasjonene i et hodefiksert paradigme og i en fritt bevegelig setting, som omfatter de allsidige eksperimentelle innstillingene 17,18,19: for eksempel er hodefiksering ofte nødvendig for velkontrollerte paradigmer som sensorisk persepsjonsvurdering og stabile opptak under 2-foton paradigme, mens fritt bevegelige gir et mer naturlig, fleksibelt miljø for atferdsstudier. Derfor er evnen til å utføre en direkte sammenligning i begge modusene avgjørende for å fremme vår forståelse av mikrokretsene som muliggjør fleksible, funksjonelle responser.
I hovedsak tilbyr integreringen av hodeplatefiksering, mikroprisme og miniskop i fluorescensavbildning en lovende plattform for å undersøke vanskelighetene med hjernens struktur og funksjonalitet. Forskere kan prøve identifiserte cellepopulasjoner over ulike dybder som spenner over alle kortikale lag, direkte sammenligne deres svar i både velkontrollerte og naturlige paradigmer, og overvåke deres langsiktige endringer over måneder20. Denne tilnærmingen gir verdifull innsikt i hvordan disse nevrale populasjonene samhandler og endres over tid under forskjellige eksperimentelle forhold, og gir et vindu inn i nevrale kretsers dynamiske natur.
Her har vi vist evnen til å observere og direkte sammenligne nevroner i hodefaste og fritt bevegelige forhold i de samme nevrale populasjonene. Mens vi demonstrerte applikasjonen i den visuelle cortexen, kan denne protokollen tilpasses en rekke andre hjerneområder, både kortikale områder og dype kjerner 24,25,26,27,28, samt annen datainnsamling og atferdsoppsett…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Charu Reddy og professor Matteo Carandini (Cortex Lab) for deres råd om kirurgisk protokoll og deling av transgen musestamme. Vi takker Dr. Norbert Hogrefe (Inscopix) for hans veiledning og hjelp gjennom utviklingen av operasjonen. Vi takker Andreea Aldea (Sun Lab) for hennes hjelp med kirurgisk oppsett og databehandling. Dette arbeidet ble støttet av Moorfields Eye Charity.
0.9% Sodium Chloride solution for infusion (Vetivex 11) 250ml | Dechra | 20091607 | Saline for hydration and drug reconsitution |
18004-1 Trephine 1.8mm diameter bur | FST | 18004-18 | Drill bit |
1ml syringe | Terumo | MDSS01SE | 1ml syringe |
23G x 5/8 inch 6% LUER needle | Terumo | NN-2316R | 23G needle |
71000 Automated stereotaxic apparatus w/ built-in software | RWD | – | RWD |
Absorbable Haemostatic Gelatin Sponge (10x10x10mm) | Surgispon | SSP-101010 | gel-foam |
Alcohol pads 70% isopropyl alcohol | Braun | 9160612 | Alcohol pads |
Aluminium foil | Any retailer | – | Foil to cover eyes during surgery |
Articifical Cerebrospinal Fluid | Tocris Bioscience a Bio-Techne Brand | 3525/25ML | ACSF |
Automated microinjection pump | WPI | 8091 | |
Betadine solution (10% iodinated Povidone) 500ml | Videne/Ecolab | 3030440 | Betadine |
Bruker Ultime 2Pplus (customised) | Bruker | – | Two-photon imaging system |
Cardiff Aldasorber | Vet-Tech | AN006 | Anaesthesia absorber |
CFI S Plan Fluor ELWD ADM 20XC | Nikon | MRH48230 | 20x objective lens |
Compact Anaesthesia system – single gas – isoflurane K/F, with oxygen concentrator model: ZY-5AC and scavenging unit | Vet-Tech | AN001 | Compact anaesthesia system |
Contec Prochlor | Aston Pharma | AP2111L1 | Disinfectant (hypochlorous acid) |
Dexamethasone Sodium Phosphate Injection, USP, 4mg/ml, NDC: 0641-6145-25 | Hikma | Covetrus:70789 | Dexamethasone |
Dissecting Knife, cutting edge 4mm, thickness 0.5mm, stainless steel | Fine Science Tools | 10055-12 | Knife for incisino of cortex |
Dual-Sided, Non-Puncture Mouse & Neonatal Rat Ear Bars | Stoelting | 51649 | Ear bar |
Dummy microscope | Inscopix | Dummy microscope | To help with implantation |
Ethanol (100%) | VWR | 40-1712-25 | Used to make 70% ethanol |
Fisherbrand Nitrile Indigo Disposable Gloves PPE Cat III | FischerScientific | 17182182 | Gloves |
Homeothermic Monitor 50-7222-F | Harvard Apparatus | 50-7222-F | Homeothermic monitoring system/heating pad |
Image processing software | ImageJ | – | Image processing software |
Inscopix Data Processing Software (IDPS) | Inscopix | – | One-photon calcium imaging processing software |
Insight Duals-232, S/N 2043 | InSight | Insight Spectra X3 | Two-photon imaging laser |
IsoFlo 250ml 100% w/w inhalation | Zoetis | WM 42058/4195 | Isoflurane |
Kwik-Sil Low Toxicity Silicone Adhesive | World Precision Intruments (WPI) | KWIK-SIL | Silicone adhesive |
MICROMOT mains adapter NG 2/S, w/ Drill unit 60/E | PROXXON | NO 28 515 | Handheld drill |
nVoke Integrated Imaging and Optogenetics System package | Inscopix | – | One-photon Imaging system and software |
ProView Implant Kit | Inscopix | ProView Implant Kit | Dummy microscope, stereotaxic arm and attachment |
ProView Prism Probe | Inscopix | 1050-002203 | Microprism lens |
Rimadyl (50mg/ml) | Zoetis | VM 42058/4123 | Carprofen |
Stereotaxis Microscope on Articulated arm with table clamp | WPI | PZMTIII-AAC | Microscope |
Super-Bond Universal kit, SUN Medical | Prestige-Dental | K058E | Adhesive cement |
Two-photon calcium image software | Suite2P | – | Two-photon calcium imaging processing software |
Vapouriser | Vet-Tech | – | Isoflurane vapouriser |
Xailin Lubricating Eye Ointment 5g | Xailin-Night | MLG/28/1551 | Ophthalmic ointment |