Summary

Mus Dermal Lymfatisk Endotelcelleisolering

Published: July 21, 2023
doi:

Summary

Denne artikel beskriver en metode til magnetisk perlebaseret isolering af murin endotelceller fra dermale lymfatiske kapillærer. De isolerede lymfatiske endotelceller kan bruges til downstream in vitro-eksperimenter og proteinekspressionsanalyse.

Abstract

Lymfesystemet deltager i reguleringen af immunovervågning, lipidabsorption og vævsvæskebalance. Isolering af murine lymfatiske endotelceller er en vigtig proces for lymfeforskning, da det tillader udførelse af in vitro og biokemiske eksperimenter på de isolerede celler. Desuden har udviklingen af Cre-lox-teknologi muliggjort den vævsspecifikke mangel på gener, der ikke kan målrettes globalt, hvilket fører til den præcise bestemmelse af deres rolle i de undersøgte væv. Dissektionen af visse geners rolle i lymfefysiologi og patofysiologi kræver brug af lymfespecifikke promotorer og dermed eksperimentel verifikation af ekspressionsniveauerne af de målrettede gener.

Metoder til effektiv isolering af lymfatiske endotelceller fra vildtypemus eller transgene mus gør det muligt at anvende ex vivo – og in vitro-assays til at undersøge de mekanismer, der regulerer lymfefunktionerne, og identifikationen af ekspressionsniveauerne for de undersøgte proteiner. Vi har udviklet, standardiseret og præsenterer en protokol for effektiv isolering af murine dermale lymfatiske endotelceller (DLEC’er) via magnetisk perleoprensning baseret på LYVE-1-ekspression. Den skitserede protokol har til formål at udstyre forskere med et værktøj til yderligere at forstå og belyse vigtige aktører i lymfatiske endotelcellefunktioner, især i faciliteter, hvor fluorescensaktiveret cellesorteringsudstyr ikke er tilgængeligt.

Introduction

Lymfesystemet spiller en central rolle i menneskets fysiologi. Det betragtes som en vital homøostatisk faktor, der letter vigtige funktioner, såsom opretholdelse af væv-plasma-væskebalance, immunovervågning og lipidabsorption1, samt nyligt identificerede funktioner, såsom hjertets reparationsevne2 og regenerativ kapacitet af knogler og hæmatopoiesis3. På trods af lymfesystemets betydelige rolle forbliver flere aspekter af lymfatikkens rolle såvel som de molekylære mekanismer, der styrer visse fysiologiske parametre og responser, undvigende. Desuden udløser eller forværrer lymfatiske vaskulære defekter faktorer ved visse patofysiologiske tilstande. Velkendte eksempler er de primære og sekundære lymfødemer, afhængigt af henholdsvis sygdommens genetiske eller ikke-genetiske oprindelse, mens lymfesystemets rolle på primær tumorvækst og metastatisk spredning er afgørende, da det kan fungere som en kanal for metastase og modulator af immunfunktioner1.

Forsinkelsen i undersøgelsen og kendskabet til lymfesystemet sammenlignet med blodvaskulaturen skyldes hovedsageligt den senere opdagelse af lymfesystemet i sammenligning med det blodvaskulære system og forsinkelsen i identifikationen af lymfespecifikke molekylære markører. Dette er blevet væsentligt forbedret i de seneste årtier, hvilket har ført til en ændring af det konventionelle billede af lymfemusklerne ved steady state og under sygetilstande 1. I lighed med angiogenese er lymfangiogenese dannelsen af nye lymfekar fra allerede eksisterende og spiller en central rolle i udviklingen af et bredt spektrum af sygdomme 4,5,6. Men i modsætning til angiogenese har undersøgelsen af lymfangiogenese været begrænset til for det meste in vivo-modeller med fokus på udvikling af kardannelse og strukturelle defekter i patologiske modeller. Isoleringen af de lymfatiske endotelceller er vigtig for in vitro-undersøgelser, og dette kan tilvejebringes af den præsenterede protokol.

Der er udviklet flere protokoller for lymfatisk endotelisolering fra mus, som kræver brug af fluorescensaktiveret cellesortering7. Fordelen ved cellesortereren, hvor den er tilgængelig, er den højere renhedsgrad i modsætning til perlebaseret isolering, hvor sidstnævnte giver et højere udbytte. Protokollen udnytter ekspressionen af lymfatisk endotelial hyaluronanreceptor 1 (LYVE-1), en lymfatisk endotelmarkør, vigtig for cellehandel i lymfekarrene 4,8. Da LYVE-1-ekspression er begrænset til de lymfatiske kapillærer og ikke de opsamlende lymfekar, er teknikken velegnet til isolering af lymfatiske endotelceller specifikt fra lymfekapillærerne, i modsætning til andre lymfatiske markører, såsom podoplanin, som udtrykkes ensartet i alle lymfatiske endotelceller9. For protokollen blev andre vigtige lymfemarkører, der ikke var transmembrane, såsom Prox1, udelukket.

Da det fysiologiske resultat var lymfangiogenese, som normalt initieres ved lymfekapillærerne, blev LYVE-1 valgt som et mål på grund af dets selektivitet i disse celler, og fordi det selekterede antistof gav et højt udbytte. De anvendte enzymer var kollagenase type II, som generelt er kendt for at være mere effektiv til kollagendissociation end type I10, og dispase, en bredere protease, der regelmæssigt bruges til dermis-epidermis-adskillelse11; dog er andre enzymer til vævsadskillelse blevet rapporteret12,13 og kan bruges. Målet med denne protokol er at beskrive en metode til dermal lymfatisk endotelcelleisolering fra lymfatiske kapillærer hos voksne mus med højt udbytte ved hjælp af magnetisk perlerensning, især på steder, hvor fluorescensaktiveret cellesortering ikke er let tilgængelig. Metoden er velegnet til applikationer, hvor renheden af lymfatiske endotelceller kan kompromitteres til downstream-applikationer.

Protocol

Dyreforsøg blev udført i henhold til de godkendte protokoller af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Texas Tech University Health Sciences Center (TTUHSC) for forsøgene ved TTUHSC og af veterinæradministrationen i præfekturet i det vestlige Grækenland i henhold til direktiv 2010/63 for eksperimenterne ved University of Patras. Følg omhyggeligt reglerne for bortskaffelse af affald ved bortskaffelse af animalsk affald. 1. Isolering af musedermis …

Representative Results

Metoden blev udviklet til at identificere proteinekspressionen af en lille GTPase, RhoA, hvis kodende gen blev floxet i begge alleler og slettet under påvirkning af den tamoxifen-inducerbare lymfatiske endotelspecifikke promotor Prox1-CreERT2 18. De isolerede LEC’er kan dyrkes i op til fire generationer, hvorefter de bliver ældre. De er blevet frosset, optøet og med succes stimuleret med angiopoietin-2. På grund af det begrænsede antal cellepassager har vi ikke prøvet fle…

Discussion

Lymfesystemet er en vigtig regulator af kroppens homøostatiske funktion, hvor de vigtigste funktioner er vedligeholdelse af væskeplasma, fjernelse af cellulære metabolismebiprodukter og toksiske molekyler, lipidabsorption og immuncellehandel 1,19. Identifikationen af passende markører har fremprovokeret en eksplosion af nye data inden for lymfeområdet, hvilket afslører nye funktioner i lymfevaskulaturen, såsom deres rolle i reparation og regenerativ evne a…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af Hellenic Foundation for Research and Innovation (00376), National Institutes of Health, National Cancer Institute (NCI) [Grant R15CA231339], Texas Tech University Health Sciences Center (TTUHSC) School of Pharmacy Office of the Sciences-bevilling (til CMM) og af College of Pharmacy, University of Louisiana Monroe start-up finansiering, National Institutes of Health (NIH) gennem National Institute of General Medical Science [Grant P20 GM103424-21] og Research Competitiveness Subprogram (RCS) fra Louisiana Board of Regents gennem Board of Regents Support Fund (LEQSF(2021-24)-RD-A-23) (til GM). Det almindelige TTUHSC-udstyr, der blev brugt, blev opnået gennem Cancer Prevention Research Institute of Texas (CPRIT) Grants RP190524 og RP200572. Bevillingsgiverne havde ingen rolle i undersøgelsens design, beslutningen om at skrive eller udarbejdelsen af manuskriptet. Det grafiske abstrakt i figur 1A blev skabt med BioRender.com.

Materials

0.2 μm Syringe Filters Fisher Scientific 09-719C
100 mm Tissue Culture Dishes Fisher Scientific FB012924
60 mm Tissue Culture Dishes Fisher Scientific FB012921
Animal Hair Clipper Wahl
Antibiotic-Antimycotic Solution 100x Fisher Scientific 15240-062
Blunt Forceps Fine Science Tools 11992-20
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A4919
Cell Strainer 40 μm Fisher Scientific 542040
Cell Strainer 70 μm Fisher Scientific 542070
CO2 Incubator
Collagen I, High Concentration Rat Tail Corning 354249 dilute in 0.02 M Acetic Acid in H2O
Collagenase Type II Life Technologies 17101-015
Dispase Life Technologies 17105-041
DMEM Fisher Scientific 11-995-073
DNAse I Solution (2,500 U/mL) Thermo Scientific 90083
Dynal MPC-L Magnetic Particle Concentrator Invitrogen 120-21D
EDTA Sigma-Aldrich 3690
Endothelial Cell Growth Base Medium & Supplement (LEC medium) R&D Systems CCM027
Euthanasia chamber Euthanex Corporation
Fine Forceps Fine Science Tools 11255-20
Fine Scissors-Sharp Fine Science Tools 14060-10
FITC anti-mouse F4/80 Antibody Biolegend 123107
Goat Anti-Rabbit IgG Magnetic Beads New England Biolabs S1432S
LARC-A E-Z Anesthesia Induction Chamber Euthanex Corporation
MagnaBind Goat Anti-Rabbit IgG Beads Thermo Scientific 21356
Paraformaldehyde Solution 4% in PBS Fisher Scientific AAJ19943K2
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Scientific SH30256FS
Rabbit Anti-Mouse LYVE-1 ReliaTech GmbH 103-PA50
Rotating/Shaking Incubator
Round-Bottom Polypropylene Tubes Corning 352063
Syringe Filters w 0.2 μm Pores Fisher Scientific 09-719C
Trypsin-EDTA Fisher Scientific 25-300-120

References

  1. Oliver, G., Kipnis, J., Randolph, G. J., Harvey, N. L. The lymphatic vasculature in the 21(st) century: novel functional roles in homeostasis and disease. Cell. 182 (2), 270-296 (2020).
  2. Liu, X., et al. Lymphoangiocrine signals promote cardiac growth and repair. Nature. 588 (7839), 705-711 (2020).
  3. Biswas, L., et al. Lymphatic vessels in bone support regeneration after injury. Cell. 186 (2), 382-397 (2023).
  4. Tammela, T., Alitalo, K. Lymphangiogenesis: molecular mechanisms and future promise. Cell. 140 (4), 460-476 (2010).
  5. Ji, R. C. The role of lymphangiogenesis in cardiovascular diseases and heart transplantation. Heart Failure Reviews. 27 (5), 1837-1856 (2022).
  6. Patnam, M., et al. Lymphangiogenesis guidance mechanisms and therapeutic implications in pathological states of the cornea. Cells. 12 (2), 319 (2023).
  7. Lokmic, Z., et al. Isolation of human lymphatic endothelial cells by multi-parameter fluorescence-activated cell sorting. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52691 (2015).
  8. Jackson, D. G. Biology of the lymphatic marker LYVE-1 and applications in research into lymphatic trafficking and lymphangiogenesis. APMIS: Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 112 (7-8), 526-538 (2004).
  9. Makinen, T., et al. PDZ interaction site in ephrinB2 is required for the remodeling of lymphatic vasculature. Genes and Development. 19 (3), 397-410 (2005).
  10. Wolters, G. H., Vos-Scheperkeuter, G. H., Lin, H. C., van Schilfgaarde, R. Different roles of class I and class II Clostridium histolyticum collagenase in rat pancreatic islet isolation. Diabetes. 44 (2), 227-233 (1995).
  11. Kubo, A., Aoki, S., Fujita, H. Whole-mount preparation and microscopic analysis of epidermis. Current Protocols. 2 (7), e464 (2022).
  12. Thiele, W., Rothley, M., Schmaus, A., Plaumann, D., Sleeman, J. Flow cytometry-based isolation of dermal lymphatic endothelial cells from newborn rats. Lymphology. 47 (4), 177-186 (2014).
  13. Kazenwadel, J., Michael, M. Z., Harvey, N. L. Prox1 expression is negatively regulated by miR-181 in endothelial cells. Blood. 116 (13), 2395-2401 (2010).
  14. Lapinski, P. E., King, P. D. Isolation and culture of mouse lymphatic endothelial cells from lung tissue. Methods in Molecular Biology. 2319, 69-75 (2021).
  15. Choi, E. Y., et al. Del-1, an endogenous leukocyte-endothelial adhesion inhibitor, limits inflammatory cell recruitment. Science. 322 (5904), 1101-1104 (2008).
  16. Mikelis, C. M., et al. RhoA and ROCK mediate histamine-induced vascular leakage and anaphylactic shock. Nature Communications. 6, 6725 (2015).
  17. Schledzewski, K., et al. Lymphatic endothelium-specific hyaluronan receptor LYVE-1 is expressed by stabilin-1+, F4/80+, CD11b+ macrophages in malignant tumours and wound healing tissue in vivo and in bone marrow cultures in vitro: implications for the assessment of lymphangiogenesis. Journal of Pathology. 209 (1), 67-77 (2006).
  18. Akwii, R. G., et al. Angiopoietin-2-induced lymphatic endothelial cell migration drives lymphangiogenesis via the beta1 integrin-RhoA-formin axis. Angiogenesis. 25 (3), 373-396 (2022).
  19. Petrova, T. V., Koh, G. Y. Biological functions of lymphatic vessels. Science. 369 (6500), eaax4063 (2020).
  20. Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis: the ‘seed and soil’ hypothesis revisited. Nature Reviews. Cancer. 3 (6), 453-458 (2003).
  21. Mellor, R. H., et al. Lymphatic dysfunction, not aplasia, underlies Milroy disease. Microcirculation. 17 (4), 281-296 (2010).
  22. Connell, F., Brice, G., Mortimer, P. Phenotypic characterization of primary lymphedema. Annals of the New York Academy of Sciences. 1131, 140-146 (2008).
  23. Croteau, S. E., et al. Kaposiform lymphangiomatosis: a distinct aggressive lymphatic anomaly. Journal of Pediatris. 164 (2), 383-388 (2014).
  24. Ji, Y., Chen, S., Peng, S., Xia, C., Li, L. Kaposiform lymphangiomatosis and kaposiform hemangioendothelioma: similarities and differences. Orphanet Journal of Rare Diseases. 14 (1), 165 (2019).
  25. Kriehuber, E., et al. Isolation and characterization of dermal lymphatic and blood endothelial cells reveal stable and functionally specialized cell lineages. Journal of Experimental Medicine. 194 (6), 797-808 (2001).
  26. Podgrabinska, S., et al. Molecular characterization of lymphatic endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).
  27. Garrafa, E., et al. Isolation, purification, and heterogeneity of human lymphatic endothelial cells from different tissues. Lymphology. 38 (4), 159-166 (2005).
  28. Kazenwadel, J., Secker, G. A., Betterman, K. L., Harvey, N. L. In vitro assays using primary embryonic mouse lymphatic endothelial cells uncover key roles for FGFR1 signalling in lymphangiogenesis. PLoS One. 7 (7), e40497 (2012).
  29. Steele, M. M., et al. T cell egress via lymphatic vessels is tuned by antigen encounter and limits tumor control. Nature Immunology. 24 (4), 664-675 (2023).
  30. Mammoto, T., et al. Effects of age-dependent changes in cell size on endothelial cell proliferation and senescence through YAP1. Aging. 11 (17), 7051-7069 (2019).
  31. Regina, C., et al. Vascular ageing and endothelial cell senescence: Molecular mechanisms of physiology and diseases. Mechanisms of Ageing and Development. 159, 14-21 (2016).
  32. Muhleder, S., Fernandez-Chacon, M., Garcia-Gonzalez, I., Benedito, R. Endothelial sprouting, proliferation, or senescence: tipping the balance from physiology to pathology. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (4), 1329-1354 (2021).

Play Video

Cite This Article
Akwii, R. G., Lamprou, M., Georgomanoli, M., Plevriti, A., Marazioti, A., Mouzaki, A., Mattheolabakis, G., Mikelis, C. M. Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation. J. Vis. Exp. (197), e65393, doi:10.3791/65393 (2023).

View Video