Denne artikel beskriver en metode til magnetisk perlebaseret isolering af murin endotelceller fra dermale lymfatiske kapillærer. De isolerede lymfatiske endotelceller kan bruges til downstream in vitro-eksperimenter og proteinekspressionsanalyse.
Lymfesystemet deltager i reguleringen af immunovervågning, lipidabsorption og vævsvæskebalance. Isolering af murine lymfatiske endotelceller er en vigtig proces for lymfeforskning, da det tillader udførelse af in vitro og biokemiske eksperimenter på de isolerede celler. Desuden har udviklingen af Cre-lox-teknologi muliggjort den vævsspecifikke mangel på gener, der ikke kan målrettes globalt, hvilket fører til den præcise bestemmelse af deres rolle i de undersøgte væv. Dissektionen af visse geners rolle i lymfefysiologi og patofysiologi kræver brug af lymfespecifikke promotorer og dermed eksperimentel verifikation af ekspressionsniveauerne af de målrettede gener.
Metoder til effektiv isolering af lymfatiske endotelceller fra vildtypemus eller transgene mus gør det muligt at anvende ex vivo – og in vitro-assays til at undersøge de mekanismer, der regulerer lymfefunktionerne, og identifikationen af ekspressionsniveauerne for de undersøgte proteiner. Vi har udviklet, standardiseret og præsenterer en protokol for effektiv isolering af murine dermale lymfatiske endotelceller (DLEC’er) via magnetisk perleoprensning baseret på LYVE-1-ekspression. Den skitserede protokol har til formål at udstyre forskere med et værktøj til yderligere at forstå og belyse vigtige aktører i lymfatiske endotelcellefunktioner, især i faciliteter, hvor fluorescensaktiveret cellesorteringsudstyr ikke er tilgængeligt.
Lymfesystemet spiller en central rolle i menneskets fysiologi. Det betragtes som en vital homøostatisk faktor, der letter vigtige funktioner, såsom opretholdelse af væv-plasma-væskebalance, immunovervågning og lipidabsorption1, samt nyligt identificerede funktioner, såsom hjertets reparationsevne2 og regenerativ kapacitet af knogler og hæmatopoiesis3. På trods af lymfesystemets betydelige rolle forbliver flere aspekter af lymfatikkens rolle såvel som de molekylære mekanismer, der styrer visse fysiologiske parametre og responser, undvigende. Desuden udløser eller forværrer lymfatiske vaskulære defekter faktorer ved visse patofysiologiske tilstande. Velkendte eksempler er de primære og sekundære lymfødemer, afhængigt af henholdsvis sygdommens genetiske eller ikke-genetiske oprindelse, mens lymfesystemets rolle på primær tumorvækst og metastatisk spredning er afgørende, da det kan fungere som en kanal for metastase og modulator af immunfunktioner1.
Forsinkelsen i undersøgelsen og kendskabet til lymfesystemet sammenlignet med blodvaskulaturen skyldes hovedsageligt den senere opdagelse af lymfesystemet i sammenligning med det blodvaskulære system og forsinkelsen i identifikationen af lymfespecifikke molekylære markører. Dette er blevet væsentligt forbedret i de seneste årtier, hvilket har ført til en ændring af det konventionelle billede af lymfemusklerne ved steady state og under sygetilstande 1. I lighed med angiogenese er lymfangiogenese dannelsen af nye lymfekar fra allerede eksisterende og spiller en central rolle i udviklingen af et bredt spektrum af sygdomme 4,5,6. Men i modsætning til angiogenese har undersøgelsen af lymfangiogenese været begrænset til for det meste in vivo-modeller med fokus på udvikling af kardannelse og strukturelle defekter i patologiske modeller. Isoleringen af de lymfatiske endotelceller er vigtig for in vitro-undersøgelser, og dette kan tilvejebringes af den præsenterede protokol.
Der er udviklet flere protokoller for lymfatisk endotelisolering fra mus, som kræver brug af fluorescensaktiveret cellesortering7. Fordelen ved cellesortereren, hvor den er tilgængelig, er den højere renhedsgrad i modsætning til perlebaseret isolering, hvor sidstnævnte giver et højere udbytte. Protokollen udnytter ekspressionen af lymfatisk endotelial hyaluronanreceptor 1 (LYVE-1), en lymfatisk endotelmarkør, vigtig for cellehandel i lymfekarrene 4,8. Da LYVE-1-ekspression er begrænset til de lymfatiske kapillærer og ikke de opsamlende lymfekar, er teknikken velegnet til isolering af lymfatiske endotelceller specifikt fra lymfekapillærerne, i modsætning til andre lymfatiske markører, såsom podoplanin, som udtrykkes ensartet i alle lymfatiske endotelceller9. For protokollen blev andre vigtige lymfemarkører, der ikke var transmembrane, såsom Prox1, udelukket.
Da det fysiologiske resultat var lymfangiogenese, som normalt initieres ved lymfekapillærerne, blev LYVE-1 valgt som et mål på grund af dets selektivitet i disse celler, og fordi det selekterede antistof gav et højt udbytte. De anvendte enzymer var kollagenase type II, som generelt er kendt for at være mere effektiv til kollagendissociation end type I10, og dispase, en bredere protease, der regelmæssigt bruges til dermis-epidermis-adskillelse11; dog er andre enzymer til vævsadskillelse blevet rapporteret12,13 og kan bruges. Målet med denne protokol er at beskrive en metode til dermal lymfatisk endotelcelleisolering fra lymfatiske kapillærer hos voksne mus med højt udbytte ved hjælp af magnetisk perlerensning, især på steder, hvor fluorescensaktiveret cellesortering ikke er let tilgængelig. Metoden er velegnet til applikationer, hvor renheden af lymfatiske endotelceller kan kompromitteres til downstream-applikationer.
Lymfesystemet er en vigtig regulator af kroppens homøostatiske funktion, hvor de vigtigste funktioner er vedligeholdelse af væskeplasma, fjernelse af cellulære metabolismebiprodukter og toksiske molekyler, lipidabsorption og immuncellehandel 1,19. Identifikationen af passende markører har fremprovokeret en eksplosion af nye data inden for lymfeområdet, hvilket afslører nye funktioner i lymfevaskulaturen, såsom deres rolle i reparation og regenerativ evne a…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Hellenic Foundation for Research and Innovation (00376), National Institutes of Health, National Cancer Institute (NCI) [Grant R15CA231339], Texas Tech University Health Sciences Center (TTUHSC) School of Pharmacy Office of the Sciences-bevilling (til CMM) og af College of Pharmacy, University of Louisiana Monroe start-up finansiering, National Institutes of Health (NIH) gennem National Institute of General Medical Science [Grant P20 GM103424-21] og Research Competitiveness Subprogram (RCS) fra Louisiana Board of Regents gennem Board of Regents Support Fund (LEQSF(2021-24)-RD-A-23) (til GM). Det almindelige TTUHSC-udstyr, der blev brugt, blev opnået gennem Cancer Prevention Research Institute of Texas (CPRIT) Grants RP190524 og RP200572. Bevillingsgiverne havde ingen rolle i undersøgelsens design, beslutningen om at skrive eller udarbejdelsen af manuskriptet. Det grafiske abstrakt i figur 1A blev skabt med BioRender.com.
0.2 μm Syringe Filters | Fisher Scientific | 09-719C | |
100 mm Tissue Culture Dishes | Fisher Scientific | FB012924 | |
60 mm Tissue Culture Dishes | Fisher Scientific | FB012921 | |
Animal Hair Clipper | Wahl | ||
Antibiotic-Antimycotic Solution 100x | Fisher Scientific | 15240-062 | |
Blunt Forceps | Fine Science Tools | 11992-20 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4919 | |
Cell Strainer 40 μm | Fisher Scientific | 542040 | |
Cell Strainer 70 μm | Fisher Scientific | 542070 | |
CO2 Incubator | |||
Collagen I, High Concentration Rat Tail | Corning | 354249 | dilute in 0.02 M Acetic Acid in H2O |
Collagenase Type II | Life Technologies | 17101-015 | |
Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
DMEM | Fisher Scientific | 11-995-073 | |
DNAse I Solution (2,500 U/mL) | Thermo Scientific | 90083 | |
Dynal MPC-L Magnetic Particle Concentrator | Invitrogen | 120-21D | |
EDTA | Sigma-Aldrich | 3690 | |
Endothelial Cell Growth Base Medium & Supplement (LEC medium) | R&D Systems | CCM027 | |
Euthanasia chamber | Euthanex Corporation | ||
Fine Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
Fine Scissors-Sharp | Fine Science Tools | 14060-10 | |
FITC anti-mouse F4/80 Antibody | Biolegend | 123107 | |
Goat Anti-Rabbit IgG Magnetic Beads | New England Biolabs | S1432S | |
LARC-A E-Z Anesthesia Induction Chamber | Euthanex Corporation | ||
MagnaBind Goat Anti-Rabbit IgG Beads | Thermo Scientific | 21356 | |
Paraformaldehyde Solution 4% in PBS | Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | SH30256FS | |
Rabbit Anti-Mouse LYVE-1 | ReliaTech GmbH | 103-PA50 | |
Rotating/Shaking Incubator | |||
Round-Bottom Polypropylene Tubes | Corning | 352063 | |
Syringe Filters w 0.2 μm Pores | Fisher Scientific | 09-719C | |
Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | 25-300-120 |