Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation(Murine 피부 림프 내피 세포 분리)
Summary
이 논문은 진피 림프 모세혈관에서 쥐 내피 세포의 자기 비드 기반 분리 방법을 설명합니다. 분리된 림프 내피 세포는 다운스트림 in vitro 실험 및 단백질 발현 분석에 사용할 수 있습니다.
Abstract
림프계는 면역 감시, 지질 흡수 및 조직액 균형의 조절에 참여합니다. 쥐 림프 내피 세포의 분리는 분리된 세포에 대한 시험관 내 및 생화학 실험을 수행할 수 있게 해주기 때문에 림프 연구에 중요한 과정입니다. 또한, Cre-lox 기술의 개발은 전 세계적으로 표적화할 수 없는 유전자의 조직 특이적 결핍을 가능하게 하여 연구된 조직에서 유전자의 역할을 정확하게 결정할 수 있게 되었습니다. 림프 생리학 및 병태 생리학에서 특정 유전자의 역할을 해부하려면 림프 특이적 프로모터의 사용이 필요하며, 따라서 표적 유전자의 발현 수준에 대한 실험적 검증이 필요합니다.
야생형 또는 형질전환 마우스에서 림프 내피 세포를 효율적으로 분리하는 방법을 통해 체외 및 시험관 내 분석을 사용하여 림프 기능을 조절하는 메커니즘을 연구하고 연구된 단백질의 발현 수준을 식별할 수 있습니다. 당사는 LYVE-1 발현을 기반으로 하는 마그네틱 비드 정제를 통해 쥐 피부 림프 내피 세포(DLEC)의 효율적인 분리를 위한 프로토콜을 개발, 표준화 및 제시합니다. 요약된 프로토콜은 특히 형광 활성화 세포 분류 장비를 사용할 수 없는 시설에서 림프 내피 세포 기능의 중요한 역할을 더 잘 이해하고 설명할 수 있는 도구를 연구자에게 제공하는 것을 목표로 합니다.
Introduction
림프계는 인체 생리학에서 중추적인 역할을 합니다. 이는 중요한 항상성 인자로 간주되며, 조직-형질액 균형 유지, 면역 감시, 지질 흡수1와 같은 중요한 기능뿐만 아니라 심장의 복구 능력2, 뼈 및 조혈 능력3의 재생 능력과 같은 최근에 확인된 기능을 촉진합니다. 림프계의 중요한 역할에도 불구하고 림프관의 역할의 여러 측면과 특정 생리학적 매개변수 및 반응을 지배하는 분자 메커니즘은 여전히 파악하기 어렵습니다. 또한, 림프 혈관 결손은 특정 병태생리학적 상태에서 유발 요인 또는 악화 요인입니다. 잘 알려진 예로는 질병의 유전적 또는 비유전적 원인에 따라 각각 원발성 림프부종과 이차성 림프부종이 있으며, 림프계는 전이를 위한 통로 역할을 하고 면역 기능을 조절하는 역할을 할 수 있기 때문에 원발성 종양 성장 및 전이성 전파에 대한 림프계의 역할은 매우 중요합니다1.
혈액 혈관에 비해 림프계에 대한 연구 및 지식의 지연은 주로 혈액 혈관 시스템에 비해 림프계가 나중에 발견되고 림프관 특이적 분자 마커의 식별이 지연되기 때문입니다. 이는 최근 수십 년 동안 크게 개선되어 정상 상태와 질병 상태에서의 림프관에 대한 기존의 그림을 변경하게 되었다1. 혈관신생과 유사하게, 림프관신생술은 기존의 림프관에서 새로운 림프관이 형성되는 것으로, 다양한 질병의 발병에 중추적인 역할을 한다 4,5,6. 그러나 혈관신생과 달리 림프관신생에 대한 연구는 주로 in vivo model에 국한되어 있으며, 병리학적 모델의 발달 혈관 형성 및 구조적 결함에 초점을 맞추고 있습니다. 림프 내피 세포의 분리는 시험관 내 연구에 중요하며, 이는 제시된 프로토콜에 의해 제공될 수 있습니다.
마우스에서 림프 내피 분리를 위한 여러 프로토콜이 개발되었으며, 이는 형광 활성화 세포 분류를 필요로 합니다7. 세포 분류기의 장점은 사용 가능한 경우 비드 기반 분리와 달리 순도가 더 높으며 비드 기반 분리가 더 높은 수율을 제공한다는 것입니다. 이 프로토콜은 림프관 내 세포 이동에 중요한 림프 내피 마커인 림프 내피 히알루론안 수용체 1(LYVE-1)의 발현을 활용합니다 4,8. LYVE-1 발현은 림프관이 수집되는 림프관이 아닌 림프 모세혈관에 국한되기 때문에, 이 기법은 모든 림프내피세포에서 균일하게 발현되는 포도플라닌(podoplanin)과 같은 다른 림프항모세포(marker)와 달리 림프내피세포를 림프혈관에서 특이적으로 분리하는 데 적합하다9. 프로토콜의 경우, Prox1과 같이 막관통이 아닌 다른 중요한 림프 마커는 제외되었습니다.
생리학적 결과는 일반적으로 림프 모세혈관에서 시작되는 림프관 형성이었기 때문에 LYVE-1은 이러한 세포에서 선택성이 있고 선택된 항체가 높은 수율을 제공하기 때문에 표적으로 선택되었습니다. 사용된 효소는 일반적으로 I형10보다 콜라겐 해리에 더 효과적인 것으로 알려진 콜라겐 분해효소 II형과 진피-표피 분리에 정기적으로 사용되는 더 넓은 프로테아제인 디스파제(dispase)였다11; 그러나, 조직 분리를 위한 다른 효소는12,13 보고되었으며 사용될 수 있습니다. 이 프로토콜의 목표는 특히 형광 활성화 세포 분류가 쉽게 가능하지 않은 장소에서 마그네틱 비드 정제를 사용하여 높은 수율로 성인 마우스의 림프 모세혈관에서 피부 림프 내피 세포를 분리하는 방법을 설명하는 것입니다. 이 방법은 림프 내피 세포의 순도가 다운스트림 응용 분야를 위해 손상될 수 있는 응용 분야에 적합합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
림프계는 신체의 항상성 기능을 조절하는 중요한 조절자이며, 가장 중요한 기능은 유체 혈장 유지, 세포 대사 부산물 및 독성 분자 제거, 지질 흡수 및 면역 세포 이동입니다 1,19. 적절한 마커의 식별은 림프관 분야에서 새로운 데이터의 폭발을 불러 일으켰으며, 특정 장기의 복구 및 재생 능력에 대한 역할과 같은 림프 혈관의 새로운 기능을 밝혀 냈습?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 Hellenic Foundation for Research and Innovation (00376), National Institutes of Health, National Cancer Institute (NCI) [Grant R15CA231339], Texas Tech University Health Sciences Center (TTUHSC) School of Pharmacy Office of the Sciences Grant (to C.M.M.), 그리고 University of Louisiana Monroe 스타트업 펀드의 약학 대학의 지원을 받았습니다. National Institute of General Medical Science[보조금 P20 GM103424-21]를 통한 NIH(National Institutes of Health) 및 이사회 지원 기금(LEQSF(2021-24)-RD-A-23)을 통한 루이지애나 이사회의 연구 경쟁력 하위 프로그램(RCS)(GM까지). 사용된 일반적인 TTUHSC 장비는 텍사스 암 예방 연구소(CPRIT) 보조금 RP190524 및 RP200572를 통해 입수했습니다. 연구비 제공자는 연구 설계, 집필 결정, 원고 준비에 아무런 역할도 하지 않았다. 그림 1A 의 그래픽 초록은 BioRender.com 로 작성되었습니다.
Materials
| 0.2 μm Syringe Filters | Fisher Scientific | 09-719C | |
| 100 mm Tissue Culture Dishes | Fisher Scientific | FB012924 | |
| 60 mm Tissue Culture Dishes | Fisher Scientific | FB012921 | |
| Animal Hair Clipper | Wahl | ||
| Antibiotic-Antimycotic Solution 100x | Fisher Scientific | 15240-062 | |
| Blunt Forceps | Fine Science Tools | 11992-20 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4919 | |
| Cell Strainer 40 μm | Fisher Scientific | 542040 | |
| Cell Strainer 70 μm | Fisher Scientific | 542070 | |
| CO2 Incubator | |||
| Collagen I, High Concentration Rat Tail | Corning | 354249 | dilute in 0.02 M Acetic Acid in H2O |
| Collagenase Type II | Life Technologies | 17101-015 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| DMEM | Fisher Scientific | 11-995-073 | |
| DNAse I Solution (2,500 U/mL) | Thermo Scientific | 90083 | |
| Dynal MPC-L Magnetic Particle Concentrator | Invitrogen | 120-21D | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3690 | |
| Endothelial Cell Growth Base Medium & Supplement (LEC medium) | R&D Systems | CCM027 | |
| Euthanasia chamber | Euthanex Corporation | ||
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Fine Scissors-Sharp | Fine Science Tools | 14060-10 | |
| FITC anti-mouse F4/80 Antibody | Biolegend | 123107 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG Magnetic Beads | New England Biolabs | S1432S | |
| LARC-A E-Z Anesthesia Induction Chamber | Euthanex Corporation | ||
| MagnaBind Goat Anti-Rabbit IgG Beads | Thermo Scientific | 21356 | |
| Paraformaldehyde Solution 4% in PBS | Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | SH30256FS | |
| Rabbit Anti-Mouse LYVE-1 | ReliaTech GmbH | 103-PA50 | |
| Rotating/Shaking Incubator | |||
| Round-Bottom Polypropylene Tubes | Corning | 352063 | |
| Syringe Filters w 0.2 μm Pores | Fisher Scientific | 09-719C | |
| Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | 25-300-120 |
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