Screening von Ionenkanälen in Krebszellen
Summary
Das pharmakologische Targeting von Ionenkanälen ist ein vielversprechender Ansatz zur Behandlung solider Tumore. Es werden detaillierte Protokolle zur Charakterisierung der Ionenkanalfunktion in Krebszellen und zur Untersuchung der Auswirkungen von Ionenkanalmodulatoren auf die Lebensfähigkeit von Krebs bereitgestellt.
Abstract
Ionenkanäle sind entscheidend für die Zellentwicklung und die Aufrechterhaltung der Zellhomöostase. Die Störung der Ionenkanalfunktion trägt zur Entwicklung eines breiten Spektrums von Erkrankungen oder Kanalopathien bei. Krebszellen nutzen Ionenkanäle, um ihre eigene Entwicklung voranzutreiben, sich als Tumor zu verbessern und sich in einer Mikroumgebung zu assimilieren, die verschiedene nicht-krebsartige Zellen enthält. Darüber hinaus kann ein Anstieg des Spiegels von Wachstumsfaktoren und Hormonen in der Mikroumgebung des Tumors zu einer erhöhten Expression von Ionenkanälen führen, was zur Proliferation und zum Überleben von Krebszellen beiträgt. Daher ist das pharmakologische Targeting von Ionenkanälen potenziell ein vielversprechender Ansatz zur Behandlung solider Malignome, einschließlich primärer und metastasierender Hirntumoren. In dieser Arbeit werden Protokolle zur Charakterisierung der Funktion von Ionenkanälen in Krebszellen und Ansätze zur Analyse von Modulatoren von Ionenkanälen beschrieben, um ihren Einfluss auf die Lebensfähigkeit von Krebs zu bestimmen. Dazu gehören die Färbung einer Zelle(n) für einen oder mehrere Ionenkanäle, das Testen des polarisierten Zustands von Mitochondrien, die Feststellung der Ionenkanalfunktion mithilfe von Elektrophysiologie und die Durchführung von Viabilitätstests zur Beurteilung der Wirksamkeit von Arzneimitteln.
Introduction
Membrantransportproteine sind entscheidend für die Kommunikation zwischen Zellen sowie für die Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase. Unter den Membrantransportproteinen dienen Ionenkanäle dazu, das Wachstum und die Entwicklung von Zellen voranzutreiben und den Zustand von Zellen in herausfordernden und sich verändernden Umgebungen aufrechtzuerhalten. Es wurde auch berichtet, dass Ionenkanäle die Entwicklung solider Tumore sowohl systemisch als auch im Zentralnervensystem (ZNS) vorantreiben und unterstützen1,2. Zum Beispiel sind KCa3.1-Kanäle für die Regulierung des Membranpotenzials und die Kontrolle des Zellvolumens verantwortlich, was für die Regulation des Zellzyklus wichtig ist. Es wurde berichtet, dass defekte KCa3.1-Kanäle zur abnormalen Proliferation von Tumorzellen beitragen3. Darüber hinaus können Ionenkanäle zur metastatischen Ausbreitung von Krebserkrankungen beitragen. Transiente Rezeptorpotentialkanäle (TRP) sind beispielsweise am Ca2+- undMg2+-Einstrom beteiligt; Dieser Einstrom aktiviert mehrere Kinasen und Hitzeschockproteine, die die extrazelluläre Matrix, die einen Tumor umgibt, regulieren, was wiederum für die Initiierung von Krebsmetastasen wichtig ist4.
Da Ionenkanäle zur Entstehung von Krebs beitragen können, können sie auch Ziele für die medikamentöse Krebsbehandlung sein. Zum Beispiel ist die Resistenz gegen Behandlungsmodalitäten, einschließlich Chemotherapie und neuartige Immuntherapie, mit einer Dysregulation der Ionenkanalfunktion verbunden 5,6,7. Darüber hinaus entwickeln sich Ionenkanäle zu wichtigen Angriffspunkten für Medikamente, um das Wachstum und die Entwicklung von Krebs zu hemmen, wobei umfunktionierte niedermolekulare (von der FDA zugelassene) Medikamente sowie Biopolymere, einschließlich monoklonaler Antikörper 1,2,8,9, untersucht werden. Obwohl es an dieser Front große Fortschritte gegeben hat, ist die Entdeckung von Medikamenten gegen Ionenkanalkrebs nach wie vor unterentwickelt. Dies ist zum Teil auf die besonderen Herausforderungen bei der Untersuchung von Ionenkanälen in Krebszellen zurückzuführen. Zum Beispiel gibt es technische Einschränkungen bei der Einrichtung von elektrophysiologischen Assays für langsam wirkende Verbindungen und zeitliche Unterschiede in der Kanalaktivierung und Arzneimittelwirkung. Darüber hinaus kann auch die Löslichkeit von Verbindungen den Fortschritt behindern, da die meisten der heute üblichen automatisierten elektrophysiologischen Systeme hydrophobe Substrate verwenden, die durch die Adsorption von Verbindungen zu Artefakten beitragen können. Darüber hinaus ist es technisch schwierig, große bioorganische molekulare Therapeutika wie Naturstoffe, Peptide und monoklonale Antikörper mit herkömmlichen elektrophysiologischen Assays zu screenen10. Schließlich sind die bioelektrischen Eigenschaften von Krebszellen nach wie vor unzureichend verstanden11.
Inzwischen ist die Immunfluoreszenzfärbung von Ionenkanälen oft eine Herausforderung. Dies ist zum Teil auf die Komplexität ihrer Strukturen und ihren Kontext in der Membran zurückzuführen, die sich auf die Fähigkeit auswirken, Antikörper für mikroskopische Studien sowohl zu generieren als auch einzusetzen. Es ist besonders wichtig, dass die Antikörper, die zur Färbung von Ionenkanälen verwendet werden, auf Spezifität, Affinität und Reproduzierbarkeit validiert sind. Kommerzielle Antikörper für Ionenkanäle sollten auf der Grundlage ihrer Validierungsstrategie und ihrer Publikationsbilanz in Betracht gezogen werden. Die Experimente sollten Negativkontrollen enthalten, um das Fehlen einer unspezifischen Bindung durch Knockdown oder Knockout des Zielproteins nachzuweisen. Alternativ können Zelllinien, in denen das Zielprotein fehlt oder in geringer Häufigkeit auf der Grundlage von mRNA- oder Proteinbestimmungen vorhanden ist, als Negativkontrollen dienen. Zum Beispiel zeigt diese Studie die Lokalisation der (GABA)-Rezeptor-Untereinheit Gabra5 in einer Medulloblastom-Zelllinie (D283). D283-Zellen mit einem siRNA-Knockdown und Daoy-Zellen, eine weitere Kleinhirn-Medulloblastom-Zelllinie, wurden für Gabra5 gefärbt und zeigten keine nennenswerte Färbung (Daten nicht gezeigt).
Hier werden Methoden vorgestellt, um die Funktion von Ionenkanälen sowie die Wirkung von Ionenkanalmodulatoren auf Krebszellen zu analysieren und zu testen. Es werden Protokolle für (1) die Färbung von Zellen für einen Ionenkanal, (2) die Prüfung des polarisierten Zustands von Mitochondrien, (3) die Feststellung der Ionenkanalfunktion mittels Elektrophysiologie und (4) die In-vitro-Validierung von Medikamenten bereitgestellt. Diese Protokolle konzentrieren sich auf Studien des Typ-A-Gamma-Aminobuttersäure-Rezeptors (GABA-A) 2,12,13,14,15,16, eines Chlorid-Anionenkanals und eines wichtigen inhibitorischen Neurotransmitterrezeptors. Die hier vorgestellten Methoden lassen sich jedoch auch auf viele andere Krebszellen und Ionenkanäle anwenden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Veränderungen in der Ionenkanalfunktion verändern intrazelluläre Signalkaskaden, was sich auf die Gesamtfunktion einer Zelle auswirken kann. In den letzten zehn Jahren wurde immer deutlicher, dass Ionenkanäle für das Wachstum und die Metastasierung von Krebszellen wichtig sind. Wichtig ist, dass viele Ionenkanäle primäre Ziele für zugelassene Therapeutika sind, die auf ein breites Spektrum von Erkrankungen abzielen24. Forscher haben untersucht, ob Ionenkanäle Ziele gegen Krebs sein könnt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich für die Unterstützung der Thomas E. & Pamela M. Mischell Family Foundation für S.S. und der Harold C. Schott Foundation für die Finanzierung des Harold C. Schott Stiftungslehrstuhls am UC College of Medicine durch die Harold C. Schott Foundation für S.S.
Materials
| ABS SpectraMax Plate Reader | Molecular Devices | ABS | |
| Accutase | Invitrogen | 00-4555-56 | |
| Alexa Flor 488 | Invitrogen | A32723 | Goat Anti-Rabbit |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | 100x |
| B27 Supplement | Gibco | 12587-010 | Lacks vitamin A |
| Biosafety Cabinet | LABCONCO | 302381101 | Class II, Type A2 |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1606-100 | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13-998-211 | Heracell VIOS 160i |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C7902 | Dihydrate |
| Cell Culture Dishes, 150 mm | Fisher Scientific | 12-600-004 | Cell culture treated |
| Cell Culture Flasks, 75 cm2 | Fisher Scientific | 430641U | Cell culture treated |
| Cell Culture Plates, 6 well | Fisher Scientific | 353046 | Cell culture treated |
| Cell Culture Plates, 96 well | Fisher Scientific | 353072 | Cell culture treated |
| Centrifuge | Eppendorf | EP-5804R | Refrigerated |
| Corning CoolCell | Fisher Scientific | 07-210-0006 | |
| Coverslips, 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-553-450 | Corning brand |
| D283 Med | ATCC | HTB-185 | |
| DABCO Mounting Media | EMS | 17989-97 | |
| D-Glucose | Sigma Life Sciences | D9434 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Aldrich | D2650 | Cell culture grade |
| DMEM/F12, base media | Fisher Scientific | 11330-032 | With phenol red |
| DMEM/F12, phenol red free | Fisher Scientific | 21041-025 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| Epidermal Growth Factor | STEMCELL | 78006.1 | |
| FCCP | Abcam | AB120081 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified | Gibco | 10437-028 | |
| Fibroblast Growth Factor, Basic | Millipore | GF003 | |
| GARBA5 Antibody | Aviva | ARP30687_P050 | Rabbit Polyclonal |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| Glycerol Mounting Medium | EMS | 17989-60 | With DAPI+DABCO |
| Hemocytometer | Millipore Sigma | ||
| Heparin | STEMCELL | 7980 | |
| HEPES | HyClone | SH3023701 | Solution |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | Solid |
| ImageJ | Open platform | With Fiji plugins | |
| Immuno Mount DAPI | EMS | 17989-97 | |
| KRM-II-08 | experimental compounds not available from a commercial source | ||
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | ||
| Leukemia Inhibitory Factor | Novus | N276314100U | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | M9272 | Hexahydrate |
| Microscope, Confocal | Leica | SP8 | |
| Microscope, Light | VWR | 76382-982 | DMiL Inverted |
| MTS – Promega One Step | Promega | G3581 | |
| Multi-channel pipette, 0.5-10 µL | Eppendorf | Z683914 | |
| Multi-channel pipette, 10-100 µL | Eppendorf | Z683930 | |
| Multi-channel pipette, 30-300 µL | Eppendorf | Z683957 | |
| Nest-O-Patch | Heka | ||
| Neurobasal-A Medium | Gibco | 10888022 | Without vitamin A |
| Neurobasal-A Medium | Gibco | 12348-017 | Phenol red free |
| Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| NOR-QH-II-66 | experimental compounds not available from a commercial source | ||
| Parafilm | Fisher Scientific | 50-998-944 | 4 inch width |
| Paraformaldehyde | EMS | RT-15710 | |
| PATHCHMASTER | Heka | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Perfusion System | Nanion | 4000120 | |
| PFA | EMS | RT-15710 | |
| Phosphate Bufered Saline | Fisher Scientific | AAJ75889K2 | Reagent grade |
| Poly-D-Lysine | Fisher Scientific | A3890401 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma Life Sciences | P4707 | |
| Port-a-Patch | Nanion | 21000072 | |
| Potassium Chloride | Sigma Life Sciences | P5405 | |
| Primary Antibody | Invitrogen | MA5-34653 | Rabbit Monoclonal |
| Prism | GraphPad | ||
| Propofol | Fisher Scientific | NC0758676 | 1 mL ampule |
| QH-II-66 | experimental compounds not available from a commercial source | ||
| Reagent Reservoirs | VWR | 89094-664 | Sterile |
| Slides, 75 x 25 mm | Fisher Scientific | 12-544-7 | Frosted one side |
| Sodium Bicarbonate | Corning | 25-035-Cl | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Synth-a-Freeze Medium | Gibco | R00550 | Cryopreservation |
| TMRE | Fisher Scientific | 50-196-4741 | Reagent |
| TMRE Kit | Abcam | AB113852 | Kit |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | NC0704309 | |
| Trypan Blue | Gibco | 15-250-061 | Solution, 0.4% |
| Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-072 | Solution, 0.25% |
| Vortex Mixer | VWR | 97043-562 | |
| Whatman Filter Paper | Fisher Scientific | 09-927-841 |
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