Screening dei canali ionici nelle cellule tumorali
Summary
Il targeting farmacologico dei canali ionici è un approccio promettente per il trattamento dei tumori solidi. Vengono forniti protocolli dettagliati per caratterizzare la funzione dei canali ionici nelle cellule tumorali e dosare gli effetti dei modulatori dei canali ionici sulla vitalità del cancro.
Abstract
I canali ionici sono fondamentali per lo sviluppo cellulare e il mantenimento dell’omeostasi cellulare. La perturbazione della funzione dei canali ionici contribuisce allo sviluppo di una vasta gamma di disturbi o canalopatie. Le cellule tumorali utilizzano canali ionici per guidare il proprio sviluppo, nonché per migliorare come tumore e assimilare in un microambiente che include varie cellule non cancerose. Inoltre, l’aumento dei livelli di fattori di crescita e ormoni all’interno del microambiente tumorale può comportare una maggiore espressione dei canali ionici, che contribuisce alla proliferazione e alla sopravvivenza delle cellule tumorali. Pertanto, il targeting farmacologico dei canali ionici è potenzialmente un approccio promettente per il trattamento di tumori maligni solidi, compresi i tumori cerebrali primari e metastatici. Qui vengono descritti i protocolli per caratterizzare la funzione dei canali ionici nelle cellule cancerose e gli approcci per analizzare i modulatori dei canali ionici per determinare il loro impatto sulla vitalità del cancro. Questi includono la colorazione di una cellula (s) per un canale ionico, testare lo stato polarizzato dei mitocondri, stabilire la funzione del canale ionico usando l’elettrofisiologia ed eseguire saggi di vitalità per valutare la potenza del farmaco.
Introduction
Le proteine di trasporto della membrana sono fondamentali per la comunicazione tra le cellule e per il mantenimento dell’omeostasi cellulare. Tra le proteine di trasporto di membrana, i canali ionici servono a guidare la crescita e lo sviluppo delle cellule e a mantenere lo stato delle cellule in ambienti difficili e mutevoli. È stato anche riportato che i canali ionici guidano e supportano lo sviluppo di tumori solidi, sia a livello sistemico che nel sistema nervoso centrale (SNC)1,2. Ad esempio, i canali KCa3.1 sono responsabili della regolazione del potenziale di membrana e del controllo del volume cellulare, che è importante nella regolazione del ciclo cellulare. È stato riportato che i canali difettosi di KCa3.1 contribuiscono alla proliferazione anormale delle cellule tumorali3. Inoltre, i canali ionici possono contribuire alla diffusione metastatica dei tumori. I canali del potenziale recettore transitorio (TRP), ad esempio, sono coinvolti nell’afflusso di Ca 2+ e Mg2+; Questo afflusso attiva diverse chinasi e proteine da shock termico che funzionano per regolare la matrice extracellulare che circonda un tumore, che è, a sua volta, importante per iniziare le metastasi del cancro4.
Poiché i canali ionici possono contribuire allo sviluppo di tumori, possono anche essere obiettivi per il trattamento del cancro correlato ai farmaci. Ad esempio, la resistenza alle modalità di trattamento, compresa la chemioterapia e la nuova immunoterapia, è correlata alla disregolazione della funzione dei canali ionici 5,6,7. Inoltre, i canali ionici stanno emergendo come importanti bersagli farmacologici per impedire la crescita e lo sviluppo dei tumori, con farmaci a piccole molecole riproposti (approvati dalla FDA) in fase di esame, nonché biopolimeri, compresi gli anticorpi monoclonali 1,2,8,9. Mentre ci sono stati molti progressi su questo fronte, la scoperta di farmaci per il cancro del canale ionico rimane sottosviluppata. Ciò è in parte dovuto alle sfide uniche dello studio dei canali ionici nelle cellule tumorali. Ad esempio, ci sono limitazioni tecniche nella creazione di saggi elettrofisiologici per composti ad azione lenta e differenze temporali nell’attivazione del canale e nell’azione del farmaco. Inoltre, la solubilità dei composti può anche impedire il progresso, poiché la maggior parte dei sistemi di elettrofisiologia automatizzati comunemente in uso oggi utilizzano substrati idrofobici, che possono contribuire agli artefatti a seguito dell’adsorbimento dei composti. Inoltre, le grandi terapie molecolari bioorganiche come prodotti naturali, peptidi e anticorpi monoclonali sono tecnicamente difficili da esaminare utilizzando saggi elettrofisiologici convenzionali10. Infine, le proprietà bioelettriche delle cellule tumorali rimangono poco conosciute11.
Nel frattempo, la colorazione a immunofluorescenza dei canali ionici è spesso impegnativa. Ciò è dovuto, in parte, alla complessità delle loro strutture e del loro contesto nella membrana, che influiscono sulla capacità di generare e impiegare anticorpi per gli studi di microscopia. È particolarmente importante che gli anticorpi utilizzati per colorare i canali ionici siano convalidati per specificità, affinità e riproducibilità. Gli anticorpi commerciali per i canali ionici dovrebbero essere presi in considerazione sulla base della loro strategia di convalida e del record di pubblicazione. Gli esperimenti dovrebbero includere controlli negativi per dimostrare la mancanza di legame non specifico mediante knockdown o knockout della proteina bersaglio. In alternativa, le linee cellulari in cui la proteina bersaglio è assente o in bassa abbondanza sulla base di mRNA o determinazioni proteiche possono servire come controlli negativi. Ad esempio, questo studio mostra la localizzazione della subunità del recettore (GABA) Gabra5 in una linea cellulare di medulloblastoma (D283). Le cellule D283 con un knockdown di siRNA e le cellule Daoy, un’altra linea cellulare di medulloblastoma cerebellare, sono state colorate per Gabra5 e non hanno mostrato alcuna colorazione apprezzabile (dati non mostrati).
Qui vengono presentati metodi per analizzare e saggiare la funzione dei canali ionici, nonché l’effetto dei modulatori dei canali ionici sulle cellule tumorali. Sono previsti protocolli per (1) colorare le cellule per un canale ionico, (2) testare lo stato polarizzato dei mitocondri, (3) stabilire la funzione del canale ionico usando l’elettrofisiologia e (4) convalidare il farmaco in vitro. Questi protocolli enfatizzano gli studi del recettore dell’acido gamma-aminobutirrico di tipo A (GABAA) 2,12,13,14,15,16, un canale anionico cloruro e il principale recettore inibitorio dei neurotrasmettitori. Tuttavia, i metodi qui presentati si applicano allo studio di molte altre cellule tumorali e canali ionici.
Protocol
Representative Results
Discussion
I cambiamenti nella funzione dei canali ionici alterano le cascate di segnalazione intracellulare, che possono influire sul funzionamento complessivo di una cellula. Negli ultimi dieci anni, è diventato sempre più chiaro che i canali ionici sono importanti per la crescita e le metastasi delle cellule tumorali. È importante sottolineare che molti canali ionici sono obiettivi primari per le terapie approvate mirate a una vasta gamma di disturbi24. I ricercatori hanno sondato se i canali ionici po…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono il sostegno della Thomas E. & Pamela M. Mischell Family Foundation a S.S. e il finanziamento della Harold C. Schott Foundation della Harold C. Schott Endowed Chair, UC College of Medicine, a S.S.
Materials
| ABS SpectraMax Plate Reader | Molecular Devices | ABS | |
| Accutase | Invitrogen | 00-4555-56 | |
| Alexa Flor 488 | Invitrogen | A32723 | Goat Anti-Rabbit |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | 100x |
| B27 Supplement | Gibco | 12587-010 | Lacks vitamin A |
| Biosafety Cabinet | LABCONCO | 302381101 | Class II, Type A2 |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1606-100 | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13-998-211 | Heracell VIOS 160i |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C7902 | Dihydrate |
| Cell Culture Dishes, 150 mm | Fisher Scientific | 12-600-004 | Cell culture treated |
| Cell Culture Flasks, 75 cm2 | Fisher Scientific | 430641U | Cell culture treated |
| Cell Culture Plates, 6 well | Fisher Scientific | 353046 | Cell culture treated |
| Cell Culture Plates, 96 well | Fisher Scientific | 353072 | Cell culture treated |
| Centrifuge | Eppendorf | EP-5804R | Refrigerated |
| Corning CoolCell | Fisher Scientific | 07-210-0006 | |
| Coverslips, 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-553-450 | Corning brand |
| D283 Med | ATCC | HTB-185 | |
| DABCO Mounting Media | EMS | 17989-97 | |
| D-Glucose | Sigma Life Sciences | D9434 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Aldrich | D2650 | Cell culture grade |
| DMEM/F12, base media | Fisher Scientific | 11330-032 | With phenol red |
| DMEM/F12, phenol red free | Fisher Scientific | 21041-025 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| Epidermal Growth Factor | STEMCELL | 78006.1 | |
| FCCP | Abcam | AB120081 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified | Gibco | 10437-028 | |
| Fibroblast Growth Factor, Basic | Millipore | GF003 | |
| GARBA5 Antibody | Aviva | ARP30687_P050 | Rabbit Polyclonal |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| Glycerol Mounting Medium | EMS | 17989-60 | With DAPI+DABCO |
| Hemocytometer | Millipore Sigma | ||
| Heparin | STEMCELL | 7980 | |
| HEPES | HyClone | SH3023701 | Solution |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | Solid |
| ImageJ | Open platform | With Fiji plugins | |
| Immuno Mount DAPI | EMS | 17989-97 | |
| KRM-II-08 | experimental compounds not available from a commercial source | ||
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | ||
| Leukemia Inhibitory Factor | Novus | N276314100U | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | M9272 | Hexahydrate |
| Microscope, Confocal | Leica | SP8 | |
| Microscope, Light | VWR | 76382-982 | DMiL Inverted |
| MTS – Promega One Step | Promega | G3581 | |
| Multi-channel pipette, 0.5-10 µL | Eppendorf | Z683914 | |
| Multi-channel pipette, 10-100 µL | Eppendorf | Z683930 | |
| Multi-channel pipette, 30-300 µL | Eppendorf | Z683957 | |
| Nest-O-Patch | Heka | ||
| Neurobasal-A Medium | Gibco | 10888022 | Without vitamin A |
| Neurobasal-A Medium | Gibco | 12348-017 | Phenol red free |
| Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| NOR-QH-II-66 | experimental compounds not available from a commercial source | ||
| Parafilm | Fisher Scientific | 50-998-944 | 4 inch width |
| Paraformaldehyde | EMS | RT-15710 | |
| PATHCHMASTER | Heka | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Perfusion System | Nanion | 4000120 | |
| PFA | EMS | RT-15710 | |
| Phosphate Bufered Saline | Fisher Scientific | AAJ75889K2 | Reagent grade |
| Poly-D-Lysine | Fisher Scientific | A3890401 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma Life Sciences | P4707 | |
| Port-a-Patch | Nanion | 21000072 | |
| Potassium Chloride | Sigma Life Sciences | P5405 | |
| Primary Antibody | Invitrogen | MA5-34653 | Rabbit Monoclonal |
| Prism | GraphPad | ||
| Propofol | Fisher Scientific | NC0758676 | 1 mL ampule |
| QH-II-66 | experimental compounds not available from a commercial source | ||
| Reagent Reservoirs | VWR | 89094-664 | Sterile |
| Slides, 75 x 25 mm | Fisher Scientific | 12-544-7 | Frosted one side |
| Sodium Bicarbonate | Corning | 25-035-Cl | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Synth-a-Freeze Medium | Gibco | R00550 | Cryopreservation |
| TMRE | Fisher Scientific | 50-196-4741 | Reagent |
| TMRE Kit | Abcam | AB113852 | Kit |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | NC0704309 | |
| Trypan Blue | Gibco | 15-250-061 | Solution, 0.4% |
| Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-072 | Solution, 0.25% |
| Vortex Mixer | VWR | 97043-562 | |
| Whatman Filter Paper | Fisher Scientific | 09-927-841 |
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