ثقافة مجمعة غير مجزأة لعضلات الهيكل العظمي للفأر لتلخيص هدوء الخلايا الجذعية المتخصصة
Summary
تتكون العضلات الهيكلية من أنواع متعددة من الخلايا، بما في ذلك الخلايا الجذعية المقيمة، ولكل منها مساهمة خاصة في الاتزان الداخلي للعضلات وتجديدها. هنا ، يتم وصف ثقافة 2D للخلايا الجذعية العضلية ومكانة الخلايا العضلية في بيئة خارج الجسم الحي تحافظ على العديد من الخصائص الفسيولوجية والحيوية والبيئية.
Abstract
العضلات الهيكلية هي أكبر نسيج في الجسم وتؤدي وظائف متعددة ، من الحركة إلى التحكم في درجة حرارة الجسم. تعتمد وظائفها والتعافي من الإصابات على العديد من أنواع الخلايا وعلى الإشارات الجزيئية بين خلايا العضلات الأساسية (الألياف العضلية والخلايا الجذعية العضلية) ومكانتها. لا تحافظ معظم الإعدادات التجريبية على هذه البيئة المكروية الفسيولوجية المعقدة ، كما أنها لا تسمح بالدراسة خارج الجسم الحي للخلايا الجذعية العضلية في هدوء ، وهي حالة خلوية ضرورية بالنسبة لهم. هنا ، يتم تحديد بروتوكول للثقافة خارج الجسم الحي للخلايا الجذعية العضلية مع المكونات الخلوية لمكانتها. من خلال الانهيار الميكانيكي والأنزيمي للعضلات ، يتم الحصول على مزيج من أنواع الخلايا ، والتي يتم وضعها في ثقافة 2D. يظهر التلوين المناعي أنه في غضون أسبوع 1 ، توجد خلايا متخصصة متعددة في الثقافة جنبا إلى جنب مع الألياف العضلية ، والأهم من ذلك ، الخلايا الإيجابية Pax7 التي تعرض خصائص الخلايا الجذعية العضلية الهادئة. هذه الخصائص الفريدة تجعل هذا البروتوكول أداة قوية لتضخيم الخلايا وتوليد خلايا جذعية شبيهة بالهدوء يمكن استخدامها لمعالجة الأسئلة الأساسية والانتقالية.
Introduction
تعتمد الحركة والتنفس والتمثيل الغذائي ووضعية الجسم والحفاظ على درجة حرارة الجسم على العضلات الهيكلية ، وبالتالي يمكن أن تسبب الأعطال في العضلات الهيكلية أمراضا منهكة (مثل اعتلالات العضلات وضمور العضلات وما إلى ذلك) 1. نظرا لوظائفها الأساسية ووفرتها ، جذبت العضلات الهيكلية انتباه مختبرات الأبحاث في جميع أنحاء العالم التي تسعى جاهدة لفهم الجوانب الرئيسية التي تدعم وظيفة العضلات الطبيعية ويمكن أن تكون بمثابة أهداف علاجية. بالإضافة إلى ذلك ، تعد العضلات الهيكلية نموذجا يستخدم على نطاق واسع لدراسة التجدد ووظيفة الخلايا الجذعية ، حيث يمكن للعضلات السليمة إصلاح ذاتي بالكامل بعد الإصابة الكاملة والانحطاط ، ويرجع ذلك في الغالب إلى الخلايا الجذعية المقيمة2 ؛ وتسمى هذه أيضا خلايا الأقمار الصناعية ويتم توطينها تحت الصفيحة القاعدية في محيط ألياف العضلات3.
الخلايا الأساسية للعضلات الهيكلية البالغة هي الألياف العضلية (الخلايا متعددة النوى المخلوية الطويلة) والخلايا الساتلية (الخلايا الجذعية ذات الإمكانات العضلية التي تكون هادئة حتى تنشطها الإصابة). الخلايا الأخيرة هي الخلايا المركزية لتجديد العضلات ، ولا يمكن أن تحدث هذه العملية في غيابها4،5،6،7. في بيئتها المكروية المباشرة ، هناك أنواع متعددة من الخلايا والعوامل الجزيئية التي تشير إليها. يتم تأسيس هذا المكان تدريجيا طوال فترة التطوير وحتى سنالبلوغ 8. تحتوي العضلات البالغة على أنواع متعددة من الخلايا (الخلايا البطانية ، الخلايا المحيطة ، الضامة ، السلف الليفي الدهني – FAPs ، الخلايا التائية التنظيمية ، إلخ.) 9،10 ومكونات مصفوفة خارج الخلية (اللامينين ، الكولاجين ، الفبرونيكتين ، الفيبريلين ، السمحاق ، إلخ.) 11 التي تتفاعل مع بعضها البعض ومع الخلايا الساتلية في سياق الصحة والمرض والتجديد.
يعد الحفاظ على هذا المكان المعقد في البيئات التجريبية أمرا أساسيا ولكنه يمثل تحديا. بنفس القدر من الصعوبة هو الحفاظ على الهدوء أو العودة إليه ، وهي حالة خلوية ضرورية لخلايا الأقمار الصناعية9. تم إدخال عدة طرق لمعالجة هذه التحديات جزئيا ، ولكل منها مزاياها وعيوبها (مفصلة في قسم المناقشة). هنا ، يتم تقديم طريقة يمكنها التغلب جزئيا على هذين الحاجزين. يتم حصاد العضلات في البداية ثم تكسيرها ميكانيكيا وإنزيميا قبل وضع خليط الخلايا غير المتجانسة في الثقافة. على مدار المزرعة ، يتم الكشف عن العديد من أنواع الخلايا المتخصصة ، ويتم ملاحظة خلايا الأقمار الصناعية التي عادت إلى الهدوء. كخطوة أخيرة من البروتوكول ، يتم تقديم خطوات التألق المناعي التي تسمح باكتشاف كل نوع من الخلايا من خلال استخدام علامات مقبولة عالميا.
Protocol
Representative Results
Discussion
ترتكز وظيفة العضلات الهيكلية للبالغين على مجموعة منسقة بدقة من التفاعلات الخلوية والإشارات الجزيئية. هنا ، يتم تقديم طريقة تسمح بدراسة هذه المعلمات في بيئة خارج الجسم الحي تشبه إلى حد كبير البيئة المكروية الفسيولوجية.
أبلغت عدة مجموعات في المختبر عن طرق لزراعة ا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
بالنسبة للشكل 2 ، تم استخدام قوالب من Servier Medical Art (https://smart.servier.com/). يتم دعم مختبر FR من قبل الجمعية الفرنسية لمكافحة الاعتلال العضلي – AFM عبر TRANSLAMUSCLE (المنح 19507 و 22946) ، ومؤسسة البحوث الطبية – FRM (EQU202003010217 ، ENV202004011730 ، ECO201806006793) ، الوكالة الوطنية للبحوث – ANR (ANR-21-CE13-0006-02 ، ANR-19-CE13-0010 ، ANR-10-LABX-73) ، والرابطة الوطنية لمكافحة السرطان (IP / SC-17130). لم يكن للممولين المذكورين أعلاه أي دور في تصميم أو جمع أو تحليل أو تفسير أو الإبلاغ عن هذه الدراسة أو كتابة هذه المخطوطة.
Materials
| anti-CD31 | BD | 550274 | dilution 1:100 |
| anti-FOSB | Santa Cruz | sc-7203 | dilution 1:200 |
| anti-GFP | Abcam | ab13970 | dilution 1:1000 |
| anti-Ki67 | Abcam | ab16667 | dilution 1:1000 |
| anti-MyHC | DSHB | MF20-c | dilution 1:400 |
| anti-MYOD | Active Motif | 39991 | dilution 1:200 |
| anti-MYOG | Santa Cruz | sc-576 | dilution 1:150 |
| anti-Pax7 | Santa Cruz | sc-81648 | dilution 1:100 |
| anti-PDGFRα | Invitrogen | PA5-16571 | dilution 1:50 |
| b-FGF | Peprotech | 450-33 | concentration 4 ng/mL |
| bovine serum albumin (BSA) – used for digestion | Sigma Aldrich | A7906-1006 | concentration 0.2% |
| BSA IgG-free, protease-free – used for staining | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | concentration 5% |
| cell strainer 40 um | Dominique Dutscher | 352340 | |
| cell strainer 70 um | Dominique Dutscher | 352350 | |
| cell strainer 100 um | Dominique Dutscher | 352360 | |
| Collagenase | Roche | 10103586001 | concentration 0.5 U/mL |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Euromedex | UD8050-05-A | |
| Dispase | Roche | 4942078001 | concentration 3 U/mL |
| Dissection forceps size 5 | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Dissection forceps size 55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dissection scissors (big, straight) | Fine Science Tools | 9146-11 | ideal for chopping |
| Dissection scissors (small, curved) | Fine Science Tools | 15017-10 | |
| Dissection scissors (small, straight) | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ThermoFisher | 41966-029 | |
| EdU Click-iT kit | ThermoFisher | C10340 | |
| Fetal bovine serum – option 1 | Eurobio | CVF00-01 | |
| Fetal bovine serum – option 2 | Gibco | 10270-106 | |
| Matrigel | Corning Life Sciences | 354234 | coating solution |
| Parafilm | Dominique Dutscher | 090261 | flexible film |
| Penicillin streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Paraformaldehyde – option 1 | PanReac AppliChem ITW Reagents | 211511.1209 | concentration 4% |
| Paraformaldeyde – option 2 | ThermoFisher | 28908 | concentration 4% |
| Shaking water bath | ThermoFisher | TSSWB27 | |
| TritonX100 | Sigma Aldrich | T8532-500 ML | concentration 0.5% |
| Wild-type mice | Janvier | C57BL/6NRj |
References
- Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: A brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
- Forcina, L., Cosentino, M., Musarò, A. Mechanisms regulating muscle regeneration: Insights into the interrelated and time-dependent phases of tissue healing. Cells. 9 (5), 1297 (2020).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
- Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. -. M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).
- McCarthy, J. J., et al. Effective fiber hypertrophy in satellite cell-depleted skeletal muscle. Development. 138 (17), 3657-3666 (2011).
- Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).
- Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).
- Hicks, M. R., Pyle, A. D. The emergence of the stem cell niche. Trends in Cell Biology. 33 (22), 112-123 (2022).
- Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
- Gama, J. F. G., et al. Role of regulatory T cells in skeletal muscle regeneration: A systematic review. Biomolecules. 12 (6), 817 (2022).
- Loreti, M., Sacco, A. The jam session between muscle stem cells and the extracellular matrix in the tissue microenvironment. NPJ Regenerative Medicine. 7 (1), 16 (2022).
- Sambasivan, R., et al. Distinct regulatory cascades govern extraocular and pharyngeal arch muscle progenitor cell fates. Developmental Cell. 16 (6), 810-821 (2009).
- Pereira, P. D., et al. Quantification of cell cycle kinetics by EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine)-coupled-fluorescence-intensity analysis. Oncotarget. 8 (25), 40514-40532 (2017).
- Bismuth, K., Relaix, F. Genetic regulation of skeletal muscle development. Experimental Cell Research. 316 (18), 3081-3086 (2010).
- Yin, H., Price, F., Rudnicki, M. A. Satellite cells and the muscle stem cell niche. Physiological Reviews. 93 (1), 23-67 (2013).
- Lertkiatmongkol, P., Liao, D., Mei, H., Hu, Y., Newman, P. J. Endothelial functions of platelet/endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31). Current Opinion in Hematology. 23 (3), 253-259 (2016).
- Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: From the known and the unknown. Journal of Cellular Physiology. 182 (3), 311-322 (2000).
- Abou-Khalil, R., Le Grand, F., Chazaud, B. Human and murine skeletal muscle reserve cells. Stem Cell Niche. 1035, 165-177 (2013).
- Pasut, A., Oleynik, P., Rudnicki, M. A. Isolation of muscle stem cells by fluorescence activated cell sorting cytometry. Methods in Molecular Biology. 798, 53-64 (2011).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).
- Qu, Y., Edwards, K., Barrow, J. Isolation, culture, and use of primary murine myoblasts in small-molecule screens. STAR Protocols. 4 (2), 102149 (2023).
- Danoviz, M. E., Yablonka-Reuveni, Z. Skeletal muscle satellite cells: Background and methods for isolation and analysis in a primary culture system. Methods in Molecular Biology. 798, 21-52 (2011).
- Saclier, M., Theret, M., Mounier, R., Chazaud, B. Effects of macrophage conditioned-medium on murine and human muscle cells: analysis of proliferation, differentiation, and fusion. Methods in Molecular Biology. 1556, 317-327 (2017).
- Giordani, L., et al. High-dimensional single-cell cartography reveals novel skeletal muscle-resident cell populations. Molecular Cell. 74 (3), 609-621 (2019).
- Tabula Muris Consortium et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
- Brunetti, J., Koenig, S., Monnier, A., Frieden, M. Nanopattern surface improves cultured human myotube maturation. Skeletal Muscle. 11 (1), 12 (2021).
- Denes, L. T., et al. Culturing C2C12 myotubes on micromolded gelatin hydrogels accelerates myotube maturation. Skeletal Muscle. 9 (1), 17 (2019).
- LaFramboise, W. A., et al. Effect of muscle origin and phenotype on satellite cell muscle-specific gene expression. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 35 (10), 1307-1318 (2003).
- Azhar, M., Wardhani, B. W. K., Renesteen, E. The regenerative potential of Pax3/Pax7 on skeletal muscle injury. Journal of Generic Engineering and Biotechnology. 20 (1), 143 (2022).
- Hardy, D., et al. Comparative study of injury models for studying muscle regeneration in mice. PLoS One. 11 (1), e0147198 (2016).
