Нефракционированная объемная культура скелетных мышц мышей для повторения нишевого покоя и покоя стволовых клеток
Summary
Скелетные мышцы состоят из нескольких типов клеток, включая резидентные стволовые клетки, каждый из которых вносит особый вклад в гомеостаз и регенерацию мышц. Здесь описывается 2D-культура мышечных стволовых клеток и ниша мышечных клеток в условиях ex vivo, которая сохраняет многие физиологические, in vivo и экологические характеристики.
Abstract
Скелетные мышцы являются самой большой тканью тела и выполняют множество функций, от передвижения до контроля температуры тела. Его функциональность и восстановление после травм зависят от множества типов клеток и от молекулярных сигналов между основными мышечными клетками (миоволокнами, мышечными стволовыми клетками) и их нишей. Большинство экспериментальных установок не сохраняют это сложное физиологическое микроокружение, а также не позволяют исследовать ex vivo мышечные стволовые клетки в состоянии покоя, которое имеет для них решающее значение. Здесь изложен протокол культивирования ex vivo мышечных стволовых клеток с клеточными компонентами их ниши. Путем механического и ферментативного расщепления мышц получается смесь типов клеток, которая помещается в 2D-культуру. Иммуноокрашивание показывает, что в течение 1 недели в культуре присутствуют несколько нишевых клеток наряду с миоволокнами и, что важно, Pax7-положительными клетками, которые проявляют характеристики спящих мышечных стволовых клеток. Эти уникальные свойства делают этот протокол мощным инструментом для клеточной амплификации и получения покоящихся стволовых клеток, которые могут быть использованы для решения фундаментальных и трансляционных вопросов.
Introduction
Движение, дыхание, обмен веществ, положение тела и поддержание температуры тела зависят от скелетной мускулатуры, и сбои в работе скелетных мышц могут, таким образом, вызывать изнурительные патологии (например, миопатии, мышечные дистрофии и т. д.). 1. Благодаря своим основным функциям и изобилию, скелетные мышцы привлекли внимание исследовательских лабораторий по всему миру, которые стремятся понять ключевые аспекты, поддерживающие нормальную работу мышц и служащие терапевтическими мишенями. Кроме того, скелетные мышцы являются широко используемой моделью для изучения регенерации и функции стволовых клеток, поскольку здоровые мышцы могут полностью самовосстанавливаться после полной травмы и дегенерации, в основном благодаря своим резидентным стволовым клеткам2; Они также называются сателлитными клетками и локализуются под базальной пластинкой на периферии мышечных волокон3.
Основными клетками скелетной мускулатуры взрослого человека являются миоволокна (длинные синцитиальные многоядерные клетки) и клетки-сателлиты (стволовые клетки с миогенным потенциалом, которые находятся в состоянии покоя до тех пор, пока травма не активирует их). Последние клетки являются центральными клетками мышечной регенерации, и этот процесс не может происходить при их отсутствии 4,5,6,7. В их непосредственном микроокружении есть несколько типов клеток и молекулярных факторов, которые сигнализируют о них. Эта ниша постепенно закрепляется на протяжении всего развития и до совершеннолетия8. Мышцы взрослого человека содержат несколько типов клеток (эндотелиальные клетки, перициты, макрофаги, фибро-адипогенные предшественники-FAP, регуляторные Т-клетки и т.д.). 9,10 и компоненты внеклеточного матрикса (ламинины, коллагены, фибронектин, фибриллины, периостин и др.) 11, которые взаимодействуют друг с другом и с клетками-сателлитами в контексте здоровья, болезни и регенерации.
Сохранение этой сложной ниши в экспериментальных условиях является фундаментальным, но сложным делом. Не менее трудно поддерживать или возвращаться в состояние покоя, которое имеет решающее значение для клеток-сателлитов9. Для частичного решения этих проблем было введено несколько методов, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки (подробно описаны в разделе обсуждения). Здесь представлен метод, позволяющий частично преодолеть эти два барьера. Мышцы сначала собираются, а затем разрушаются механически и ферментативно, прежде чем гетерогенная клеточная смесь будет помещена в культуру. В ходе культивирования обнаруживаются многие типы клеток ниши, а также наблюдаются клетки-сателлиты, вернувшиеся в состояние покоя. В качестве последнего шага протокола представлены этапы иммунофлюоресценции, которые позволяют обнаружить каждый тип клеток с помощью общепринятых маркеров.
Protocol
Representative Results
Discussion
Функция скелетных мышц взрослого человека подкрепляется тонко организованным набором клеточных взаимодействий и молекулярных сигналов. Здесь представлен метод, позволяющий изучать эти параметры в условиях ex vivo , близком к физиологическому микроокружению.
Нескол?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Для рисунка 2 были использованы шаблоны Servier Medical Art (https://smart.servier.com/). Лаборатория FR поддерживается Французской ассоциацией по борьбе с миопатиями – AFM через TRANSLAMUSCLE (гранты 19507 и 22946), Фондом медицинских исследований – FRM (EQU202003010217, ENV202004011730, ECO201806006793), Национальным агентством исследований – ANR (ANR-21-CE13-0006-02, ANR-19-CE13-0010, ANR-10-LABX-73) и Высшей лигой по борьбе с раком (IP/SC-17130). Вышеупомянутые спонсоры не играли никакой роли в разработке, сборе, анализе, интерпретации или представлении информации об этом исследовании или написании этой рукописи.
Materials
| anti-CD31 | BD | 550274 | dilution 1:100 |
| anti-FOSB | Santa Cruz | sc-7203 | dilution 1:200 |
| anti-GFP | Abcam | ab13970 | dilution 1:1000 |
| anti-Ki67 | Abcam | ab16667 | dilution 1:1000 |
| anti-MyHC | DSHB | MF20-c | dilution 1:400 |
| anti-MYOD | Active Motif | 39991 | dilution 1:200 |
| anti-MYOG | Santa Cruz | sc-576 | dilution 1:150 |
| anti-Pax7 | Santa Cruz | sc-81648 | dilution 1:100 |
| anti-PDGFRα | Invitrogen | PA5-16571 | dilution 1:50 |
| b-FGF | Peprotech | 450-33 | concentration 4 ng/mL |
| bovine serum albumin (BSA) – used for digestion | Sigma Aldrich | A7906-1006 | concentration 0.2% |
| BSA IgG-free, protease-free – used for staining | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | concentration 5% |
| cell strainer 40 um | Dominique Dutscher | 352340 | |
| cell strainer 70 um | Dominique Dutscher | 352350 | |
| cell strainer 100 um | Dominique Dutscher | 352360 | |
| Collagenase | Roche | 10103586001 | concentration 0.5 U/mL |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Euromedex | UD8050-05-A | |
| Dispase | Roche | 4942078001 | concentration 3 U/mL |
| Dissection forceps size 5 | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Dissection forceps size 55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dissection scissors (big, straight) | Fine Science Tools | 9146-11 | ideal for chopping |
| Dissection scissors (small, curved) | Fine Science Tools | 15017-10 | |
| Dissection scissors (small, straight) | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ThermoFisher | 41966-029 | |
| EdU Click-iT kit | ThermoFisher | C10340 | |
| Fetal bovine serum – option 1 | Eurobio | CVF00-01 | |
| Fetal bovine serum – option 2 | Gibco | 10270-106 | |
| Matrigel | Corning Life Sciences | 354234 | coating solution |
| Parafilm | Dominique Dutscher | 090261 | flexible film |
| Penicillin streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Paraformaldehyde – option 1 | PanReac AppliChem ITW Reagents | 211511.1209 | concentration 4% |
| Paraformaldeyde – option 2 | ThermoFisher | 28908 | concentration 4% |
| Shaking water bath | ThermoFisher | TSSWB27 | |
| TritonX100 | Sigma Aldrich | T8532-500 ML | concentration 0.5% |
| Wild-type mice | Janvier | C57BL/6NRj |
References
- Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: A brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
- Forcina, L., Cosentino, M., Musarò, A. Mechanisms regulating muscle regeneration: Insights into the interrelated and time-dependent phases of tissue healing. Cells. 9 (5), 1297 (2020).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
- Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. -. M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).
- McCarthy, J. J., et al. Effective fiber hypertrophy in satellite cell-depleted skeletal muscle. Development. 138 (17), 3657-3666 (2011).
- Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).
- Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).
- Hicks, M. R., Pyle, A. D. The emergence of the stem cell niche. Trends in Cell Biology. 33 (22), 112-123 (2022).
- Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
- Gama, J. F. G., et al. Role of regulatory T cells in skeletal muscle regeneration: A systematic review. Biomolecules. 12 (6), 817 (2022).
- Loreti, M., Sacco, A. The jam session between muscle stem cells and the extracellular matrix in the tissue microenvironment. NPJ Regenerative Medicine. 7 (1), 16 (2022).
- Sambasivan, R., et al. Distinct regulatory cascades govern extraocular and pharyngeal arch muscle progenitor cell fates. Developmental Cell. 16 (6), 810-821 (2009).
- Pereira, P. D., et al. Quantification of cell cycle kinetics by EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine)-coupled-fluorescence-intensity analysis. Oncotarget. 8 (25), 40514-40532 (2017).
- Bismuth, K., Relaix, F. Genetic regulation of skeletal muscle development. Experimental Cell Research. 316 (18), 3081-3086 (2010).
- Yin, H., Price, F., Rudnicki, M. A. Satellite cells and the muscle stem cell niche. Physiological Reviews. 93 (1), 23-67 (2013).
- Lertkiatmongkol, P., Liao, D., Mei, H., Hu, Y., Newman, P. J. Endothelial functions of platelet/endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31). Current Opinion in Hematology. 23 (3), 253-259 (2016).
- Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: From the known and the unknown. Journal of Cellular Physiology. 182 (3), 311-322 (2000).
- Abou-Khalil, R., Le Grand, F., Chazaud, B. Human and murine skeletal muscle reserve cells. Stem Cell Niche. 1035, 165-177 (2013).
- Pasut, A., Oleynik, P., Rudnicki, M. A. Isolation of muscle stem cells by fluorescence activated cell sorting cytometry. Methods in Molecular Biology. 798, 53-64 (2011).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).
- Qu, Y., Edwards, K., Barrow, J. Isolation, culture, and use of primary murine myoblasts in small-molecule screens. STAR Protocols. 4 (2), 102149 (2023).
- Danoviz, M. E., Yablonka-Reuveni, Z. Skeletal muscle satellite cells: Background and methods for isolation and analysis in a primary culture system. Methods in Molecular Biology. 798, 21-52 (2011).
- Saclier, M., Theret, M., Mounier, R., Chazaud, B. Effects of macrophage conditioned-medium on murine and human muscle cells: analysis of proliferation, differentiation, and fusion. Methods in Molecular Biology. 1556, 317-327 (2017).
- Giordani, L., et al. High-dimensional single-cell cartography reveals novel skeletal muscle-resident cell populations. Molecular Cell. 74 (3), 609-621 (2019).
- Tabula Muris Consortium et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
- Brunetti, J., Koenig, S., Monnier, A., Frieden, M. Nanopattern surface improves cultured human myotube maturation. Skeletal Muscle. 11 (1), 12 (2021).
- Denes, L. T., et al. Culturing C2C12 myotubes on micromolded gelatin hydrogels accelerates myotube maturation. Skeletal Muscle. 9 (1), 17 (2019).
- LaFramboise, W. A., et al. Effect of muscle origin and phenotype on satellite cell muscle-specific gene expression. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 35 (10), 1307-1318 (2003).
- Azhar, M., Wardhani, B. W. K., Renesteen, E. The regenerative potential of Pax3/Pax7 on skeletal muscle injury. Journal of Generic Engineering and Biotechnology. 20 (1), 143 (2022).
- Hardy, D., et al. Comparative study of injury models for studying muscle regeneration in mice. PLoS One. 11 (1), e0147198 (2016).
