Cultivo masivo no fraccionado de músculo esquelético de ratón para recapitular la quiescencia de nicho y de células madre
Summary
El músculo esquelético comprende múltiples tipos de células, incluidas las células madre residentes, cada una con una contribución especial a la homeostasis y regeneración muscular. Aquí, se describe el cultivo 2D de células madre musculares y el nicho de células musculares en un entorno ex vivo que conserva muchas de las características fisiológicas, in vivo y ambientales.
Abstract
El músculo esquelético es el tejido más grande del cuerpo y realiza múltiples funciones, desde la locomoción hasta el control de la temperatura corporal. Su funcionalidad y recuperación de lesiones dependen de multitud de tipos celulares y de señales moleculares entre las células musculares centrales (miofibras, células madre musculares) y su nicho. La mayoría de los entornos experimentales no preservan este complejo microambiente fisiológico, y tampoco permiten el estudio ex vivo de las células madre musculares en quiescencia, un estado celular que es crucial para ellas. Aquí, se describe un protocolo para el cultivo ex vivo de células madre musculares con componentes celulares de su nicho. A través de la descomposición mecánica y enzimática de los músculos, se obtiene una mezcla de tipos celulares, que se pone en cultivo 2D. La inmunotinción muestra que en 1 semana, múltiples células de nicho están presentes en cultivo junto con miofibras y, lo que es más importante, células Pax7 positivas que muestran las características de las células madre musculares quiescentes. Estas propiedades únicas hacen de este protocolo una poderosa herramienta para la amplificación celular y la generación de células madre quiescentes que se pueden utilizar para abordar cuestiones fundamentales y traslacionales.
Introduction
El movimiento, la respiración, el metabolismo, la postura corporal y el mantenimiento de la temperatura corporal dependen del músculo esquelético, y las disfunciones en el músculo esquelético pueden, por lo tanto, causar patologías debilitantes (es decir, miopatías, distrofias musculares, etc.) 1. Dadas sus funciones esenciales y su abundancia, el músculo esquelético ha atraído la atención de laboratorios de investigación de todo el mundo que se esfuerzan por comprender los aspectos clave que apoyan la función muscular normal y pueden servir como objetivos terapéuticos. Además, el músculo esquelético es un modelo ampliamente utilizado para estudiar la regeneración y la función de las células madre, ya que el músculo sano puede autorrepararse completamente después de una lesión y degeneración completas, principalmente debido a sus células madre residentes2; Estas también se denominan células satélite y se localizan debajo de la lámina basal en la periferia de las fibras musculares3.
Las células centrales del músculo esquelético adulto son las miofibras (células multinucleares sincitiales largas) y las células satélite (células madre con potencial miogénico que están inactivas hasta que una lesión las activa). Estas últimas células son las células centrales de la regeneración muscular, y este proceso no puede ocurrir en su ausencia 4,5,6,7. En su microambiente inmediato, hay múltiples tipos de células y factores moleculares que les señalan. Este nicho se establece gradualmente a lo largo del desarrollo y hasta la edad adulta8. El músculo adulto contiene múltiples tipos de células (células endoteliales, pericitos, macrófagos, progenitores fibro-adipogénicos-FAPs, células T reguladoras, etc.) 9,10 y componentes de la matriz extracelular (lamininas, colágenos, fibronectina, fibrilinas, periostina, etc.) 11 que interactúan entre sí y con las células satélite en el contexto de la salud, la enfermedad y la regeneración.
Preservar este complejo nicho en entornos experimentales es fundamental pero desafiante. Igualmente difícil es mantener o volver a la quiescencia, un estado celular que es crítico para las células satélite9. Se han introducido varios métodos para abordar parcialmente estos desafíos, cada uno con sus ventajas y desventajas (detalladas en la sección de discusión). Aquí, se presenta un método que puede superar parcialmente estas dos barreras. Los músculos se cosechan inicialmente y luego se descomponen mecánica y enzimáticamente antes de que la mezcla celular heterogénea se ponga en cultivo. En el transcurso del cultivo, se detectan muchos tipos de células del nicho y se observan células satélite que han vuelto a la quiescencia. Como último paso del protocolo, se presentan los pasos de inmunofluorescencia que permiten la detección de cada tipo celular mediante el uso de marcadores universalmente aceptados.
Protocol
Representative Results
Discussion
La función del músculo esquelético adulto está respaldada por un conjunto finamente orquestado de interacciones celulares y señales moleculares. Aquí, se presenta un método que permite el estudio de estos parámetros en un entorno ex vivo que se asemeja mucho al microambiente fisiológico.
Varios grupos han reportado métodos in vitro para cultivar células miogénicas. Estos métodos tenían como objetivo aislar células satélite para estudiar sus propiedades progeni…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Para la Figura 2 se utilizaron plantillas de Servier Medical Art (https://smart.servier.com/). El laboratorio FR cuenta con el apoyo de la Association Française contre les Miopathies – AFM via TRANSLAMUSCLE (subvenciones 19507 y 22946), la Fondation pour la Recherche Médicale – FRM (EQU202003010217, ENV202004011730, ECO201806006793), la Agence Nationale pour la Recherche – ANR (ANR-21-CE13-0006-02, ANR-19-CE13-0010, ANR-10-LABX-73) y La Ligue Contre le Cancer (IP/SC-17130). Los financiadores mencionados anteriormente no tuvieron ningún papel en el diseño, la recopilación, el análisis, la interpretación o la presentación de informes de este estudio o la redacción de este manuscrito.
Materials
| anti-CD31 | BD | 550274 | dilution 1:100 |
| anti-FOSB | Santa Cruz | sc-7203 | dilution 1:200 |
| anti-GFP | Abcam | ab13970 | dilution 1:1000 |
| anti-Ki67 | Abcam | ab16667 | dilution 1:1000 |
| anti-MyHC | DSHB | MF20-c | dilution 1:400 |
| anti-MYOD | Active Motif | 39991 | dilution 1:200 |
| anti-MYOG | Santa Cruz | sc-576 | dilution 1:150 |
| anti-Pax7 | Santa Cruz | sc-81648 | dilution 1:100 |
| anti-PDGFRα | Invitrogen | PA5-16571 | dilution 1:50 |
| b-FGF | Peprotech | 450-33 | concentration 4 ng/mL |
| bovine serum albumin (BSA) – used for digestion | Sigma Aldrich | A7906-1006 | concentration 0.2% |
| BSA IgG-free, protease-free – used for staining | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | concentration 5% |
| cell strainer 40 um | Dominique Dutscher | 352340 | |
| cell strainer 70 um | Dominique Dutscher | 352350 | |
| cell strainer 100 um | Dominique Dutscher | 352360 | |
| Collagenase | Roche | 10103586001 | concentration 0.5 U/mL |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Euromedex | UD8050-05-A | |
| Dispase | Roche | 4942078001 | concentration 3 U/mL |
| Dissection forceps size 5 | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Dissection forceps size 55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dissection scissors (big, straight) | Fine Science Tools | 9146-11 | ideal for chopping |
| Dissection scissors (small, curved) | Fine Science Tools | 15017-10 | |
| Dissection scissors (small, straight) | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ThermoFisher | 41966-029 | |
| EdU Click-iT kit | ThermoFisher | C10340 | |
| Fetal bovine serum – option 1 | Eurobio | CVF00-01 | |
| Fetal bovine serum – option 2 | Gibco | 10270-106 | |
| Matrigel | Corning Life Sciences | 354234 | coating solution |
| Parafilm | Dominique Dutscher | 090261 | flexible film |
| Penicillin streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Paraformaldehyde – option 1 | PanReac AppliChem ITW Reagents | 211511.1209 | concentration 4% |
| Paraformaldeyde – option 2 | ThermoFisher | 28908 | concentration 4% |
| Shaking water bath | ThermoFisher | TSSWB27 | |
| TritonX100 | Sigma Aldrich | T8532-500 ML | concentration 0.5% |
| Wild-type mice | Janvier | C57BL/6NRj |
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