Summary

Doppia immunofluorescenza di γH2AX e 53BP1 nei linfociti periferici umani

Published: July 14, 2023
doi:

Summary

Questo protocollo presenta un metodo per valutare la formazione e la riparazione delle rotture a doppio filamento del DNA attraverso la rilevazione simultanea di focolai di γH2AX e 53BP1 nei nuclei interfase dei linfociti periferici umani trattati con bleomicina.

Abstract

Le rotture del doppio filamento (DSB) sono una delle lesioni più gravi che possono verificarsi nei nuclei cellulari e, se non riparate, possono portare a esiti gravi, incluso il cancro. La cellula è quindi dotata di meccanismi complessi per riparare le DSB, e queste vie coinvolgono l’istone H2AX nella sua forma fosforilata a Ser-139 (cioè γH2AX) e p53 binding protein 1 (53BP1). Poiché entrambe le proteine possono formare focolai nei siti delle DSB, l’identificazione di questi marcatori è considerata un metodo adatto per studiare sia le DSB che la loro cinetica di riparazione. Secondo i processi molecolari che portano alla formazione di focolai di γH2AX e 53BP1, potrebbe essere più utile indagare la loro co-localizzazione vicino alle DSB al fine di impostare un approccio alternativo che consenta di quantificare le DSB mediante la rilevazione simultanea di due marcatori di danno al DNA. Pertanto, questo protocollo mira a valutare il danno genomico indotto nei linfociti umani dall’agente radiomimetico bleomicina attraverso la presenza di focolai di γH2AX e 53BP1 in una doppia immunofluorescenza. Utilizzando questa metodologia, abbiamo anche delineato la variazione del numero di focolai di γH2AX e 53BP1 nel tempo, come tentativo preliminare di studiare la cinetica di riparazione dei DSB indotti da bleomicina.

Introduction

Il danno al DNA è continuamente indotto da agenti che possono essere endogeni, come i ROS generati dal metabolismo ossidativo cellulare, o esogeni, sia chimici che fisici1. Tra le lesioni più dannose, le rotture a doppio filamento (DSB) svolgono un ruolo fondamentale nel contribuire all’instabilità genomica, poiché causano aberrazioni cromosomiche che a loro volta possono avviare il processo di carcinogenesi. Pertanto, le cellule sono dotate di meccanismi complessi ed efficienti di riparazione dei DSB2.

Quando si verifica un DSB, la cellula innesca la risposta al danno del DNA (DDR) dove, insieme al complesso MRE11 / RAD50 / NBS1, vengono reclutate chinasi ATM o ATR per attivare altre proteine che rallentano o fermano il ciclo cellulare3. Un bersaglio essenziale di queste chinasi è l’istone H2AX, che è fosforilato su Ser-139 entro poche megabasi dai DSB (vale a dire γH2AX), consentendo così il reclutamento di diversi fattori di riparazione come, tra gli altri, BRCA1 e p53 binding protein 1 (53BP1)3. Successivamente, viene attivato un percorso tra ricombinazione omologa (HR), giunzione finale non omologa (NHEJ) o ricottura a singolo filamento (SSA) per riparare i DSB 4,5. Pertanto, 53BP1 è coinvolto nel dettare la scelta tra HR o NHEJ, promuovendo principalmente l’attivazione di NHEJ piuttosto che HR6. Inoltre, sia la forma fosforilata dell’istone H2AX che il 53BP1 possono formare focolai nei siti delle DSB. Poiché questi focolai persistono fino a quando non viene ripristinata l’integrità del doppio filamento, valutare l’aspetto/scomparsa dei focolai di γH2AX o 53BP1 entro un intervallo di tempo è considerato un metodo utile per valutare l’insorgenza e la riparazione di DSB in un sistema cellulare 6,7. Tuttavia, secondo i processi molecolari sopra descritti, poiché ci si aspetta che γH2AX e 53BP1 si co-localizzino vicino ai DSB durante DDR8,9, può essere utile rilevare contemporaneamente la presenza di questi marcatori in una doppia immunofluorescenza.

Pertanto, lo scopo di questo manoscritto era quello di valutare l’idoneità della quantificazione simultanea dei focolai di γH2AX e 53BP1 per valutare il danno genomico indotto nei linfociti periferici umani dall’agente radiomimetico bleomicina. Utilizzando la stessa metodologia, abbiamo anche tentato di delineare la cinetica di riparazione dei DSB indotti da bleomicina secondo una procedura sperimentale precedentemente impostata10.

Protocol

Lo studio è stato approvato dal comitato etico dell’Università di Pisa e il consenso informato e firmato è stato ottenuto da ciascun donatore. 1. Formazione di focolai γH2AX e 53BP1 Preparazione dei campioni e trattamento mutagenoRaccogliere campioni di sangue intero mediante venipuntura da individui adulti sani in provette di raccolta del sangue (ad esempio, Vacutainer) contenenti eparina di litio come anticoagulante. Al fine di garan…

Representative Results

I dati ottenuti dall’analisi al microscopio a fluorescenza dei linfociti periferici ci permettono di valutare tre aspetti principali: l’efficacia del trattamento con bleomicina nell’aumentare il numero di focolai di γH2AX e 53BP1 (e quindi di DSB) a causa del suo effetto mutageno, in che misura entrambi i focolai sono co-localizzati nel sito delle DSB e il decorso temporale dei focolai di γH2AX e 53BP1 per delineare la cinetica di riparazione dei DSB indotti da bleomicina. Come previsto, è stata osservata una frequenz…

Discussion

L’analisi di immunofluorescenza dei focolai di γH2AX e 53BP1 è un metodo adatto per valutare il danno genomico nei nuclei interfase di un sistema cellulare. Questa procedura presenta diversi punti critici che possono influenzare l’esito degli esperimenti, principalmente gli agenti utilizzati nella fissazione e permeabilizzazione, il tipo di anticorpi e i loro fattori di diluizione e la concentrazione del mutageno.

Il mantenimento dell’integrità proteica è fondamentale poiché il metodo del…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Siamo grati a tutti i donatori di sangue e a tutto il personale sanitario che ha prelevato i campioni di sangue.

Materials

AlexaFluor 568 goat anti-mouse IgG (γ1) Invitrogen A21124 53BP1 secondary antibody
Bleoprim Sanofi bleomycin sulfate (mutagen)
Penicillin-streptomycin solution 100X Euroclone ECB3001D antibiotics for culture medium
PBS 10X Termofisher 14200075 Phosphate-buffered saline
FBS Euroclone EC20180L Fetal Bovine Serum for immunofluorescence
Goat anti-rabbit IgG (H+L) DyLight 488 Coniugated Termofisher #35552 γH2AX secondary antibody
Mouse anti-53BP1 monoclonal antibody Merck MAB 3802 53BP1 primary antibody
Labophot 2 Nikon Fluorescence microscope
P-histone H2AX (Ser139) rabbit antibody Cell Signaling #2577 γH2AX primary antibody
Phytohemoagglutinin Termofisher R30852801 component of culture medium
Prolong gold antifade reagent with DAPI Cell Signaling #8961 Antifade solution with DAPI for counterstaining
RPMI 1640 Euroclone ECB9006L Culture medium
Triton-X100 Sigma T9284 Nonionic detergent for permeabilization

References

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Cite This Article
Falaschi, A., Chiaramonte, A., Testi, S., Scarpato, R. Dual Immunofluorescence of γH2AX and 53BP1 in Human Peripheral Lymphocytes. J. Vis. Exp. (197), e65472, doi:10.3791/65472 (2023).

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