Opretholdelse af oocytgenomintegritet er nødvendig for at sikre den genetiske troskab i det resulterende embryo. Her præsenterer vi en nøjagtig protokol til påvisning af DNA-dobbeltstrengsbrud i pattedyrs kvindelige kønsceller.
Oocytter er blandt de største og mest langlivede celler i den kvindelige krop. De dannes i æggestokkene under embryonal udvikling og forbliver arresteret i profasen af meiose I. Den hvilende tilstand kan vare i årevis, indtil oocytterne får en stimulans til at vokse og opnå kompetence til at genoptage meiose. Denne langvarige tilstand af anholdelse gør dem yderst modtagelige for at akkumulere DNA-skadelige fornærmelser, som påvirker de kvindelige køns genetiske integritet og dermed det fremtidige embryos genetiske integritet.
Derfor er udviklingen af en nøjagtig metode til påvisning af DNA-skader, som er det første skridt i etableringen af DNA-skaderesponsmekanismer, af afgørende betydning. Dette papir beskriver en fælles protokol til at teste tilstedeværelsen og udviklingen af DNA-skader i profasearresterede oocytter i en periode på 20 timer. Specifikt dissekerer vi museæggestokke, henter cumulus-oocytkomplekserne (COC’er), fjerner cumuluscellerne fra COC’erne og dyrker oocytterne i Μ2-medium indeholdende 3-isobutyl-1-methylxanthin for at opretholde arrestationstilstanden. Derefter behandles oocytterne med det cytotoksiske, antineoplasmatiske lægemiddel, etoposid, for at skabe dobbeltstrengsbrud (DSB’er).
Ved hjælp af immunfluorescens og konfokalmikroskopi detekterer og kvantificerer vi niveauerne af kerneproteinet γH2AX, som er den fosforylerede form af histonen H2AX. H2AX bliver fosforyleret på DSB’ernes steder efter DNA-skader. Manglende evne til at genoprette DNA-integritet efter DNA-skade i oocytter kan føre til infertilitet, fødselsdefekter og øgede spontane aborter. Derfor er forståelsen af DNA-skaderesponsmekanismer og samtidig etableringen af en intakt metode til undersøgelse af disse mekanismer afgørende for reproduktivbiologisk forskning.
Processen med meiose i pattedyrs kvindelige kønsceller initieres i æggestokkene før fødslen. Det samlede antal oocytter etableres i æggestokkene primært under embryogenese. Oocytter går ind i meiose og forbliver arresteret i profaseI 1. Efter pubertetens begyndelse og produktion og endokrin virkning af follikelstimulerende hormon (FSH) og luteiniserende hormon (LH) kan oocytter genoptage og fuldføre meiose2. Hos mennesker kan profasearrest vare i op til 50 år3. Celledelingerne efter indgangen til meiose I er asymmetriske, hvilket resulterer i produktion af en lille polær krop og en oocyt, der bevarer sin størrelse. Således opbevares de fleste cytoplasmatiske komponenter i ooplasma under tidlig embryogenese4. Derefter går oocytterne ind i meiose II uden at reformere deres kerne eller dekondensere deres kromosomer og forbliver arresteret i metafase II indtil befrugtning5.
En unik egenskab, der adskiller oocytter fra somatiske celler, er tilstanden af anholdelse i profase I, når oocyten besidder en intakt kerne (germinal vesikel [GV] arrest), kaldet GV fase6. Baseret på kromatinorganisationen klassificeres GV-trinoocytter i to kategorier: ikke-omgivet nukleolus (NSN) og omgivet nukleolus (SN)7,8. I NSN GV-trins oocytter spredes kromatinet gennem hele kerneområdet, og transkription er aktiv, mens kromatinet i SN-oocytter danner en kompakt ring, der omgiver kernen, og transkriptionen er tavs9. Begge typer GV-trins oocytter viser meiotisk kompetence; de går ind i meiose med samme hastighed, men NSN-oocytterne har lav udviklingskapacitet og kan ikke udvikle sig ud over tocellestadiet embryo10.
Den langvarige tilstand af profase I-anholdelse øger forekomsten af akkumulering af DNA-skader11. Derfor er DNA-skaderesponsmekanismer i oocytter afgørende for at muliggøre produktion af kønsceller med genetisk integritet og for at sikre, at det resulterende embryo har et fysiologisk kromosomindhold.
Et centralt aspekt af DNA-skaderesponsen er DNA-reparation. De vigtigste veje til DSB-reparation i eukaryote celler inkluderer ikke-homolog endesammenføjning (NHEJ), homolog rekombination (HR) og alternativ NHEJ12,13,14,15. NHEJ er en hurtigere, men mere fejlbehæftet mekanisme, mens HR kræver mere tid at gennemføre, men har høj nøjagtighed16.
Der er ikke nok viden om de mekanismer, som oocytter bruger til reparation af DNA-skader. Undersøgelser har vist, at DNA-skader induceret i fuldvoksne pattedyroocytter ved anvendelse af genotoksiske midler, såsom etoposid, doxorubicin eller UVB eller ioniserende stråling, ikke påvirker tidspunktet og hastigheden for udgang fra profase I-anholdelse17. Oocytter kan gennemgå GV-nedbrydning (GVBD) selv i nærvær af forhøjede niveauer af skade. Denne skade kan bestemmes ved observation af γH2AX. Denne fosforylerede form af H2AX (γΗ2ΑΧ) er en DSB-markør, som er placeret på stedet for pauser og fungerer som et stillads for at hjælpe med at reparere faktorer og proteiner til at akkumulere i ødelagte ender18.
Fraværet af cellecyklusstop efter DNA-skade skyldes et utilstrækkeligt DNA-skadekontrolpunkt, der gør det muligt for oocytter med urepareret DNA at genindtaste meiose. Efter høje niveauer af DNA-skade kan et kontrolpunkt opretholde profasearrest gennem aktivering af en ATM / Chk1-afhængig vej. Den begrænsede kontrolpunktsrespons på DSB’er skyldes den begrænsede aktivering af ATM17,19. I M-fasen af meiose I har forskning vist, at DNA-skader kan aktivere et spindelsamlingskontrolpunkt (SAC) -induceret meiose I-kontrolpunkt, som forhindrer aktivering af E3 ubiquitinligaseanafasefremmende kompleks / cyklosomet (APC / C) og derfor M-faseudgang. Desuden overvinder ablationen af SAC-proteiner tilstanden af M-fasearrest, hvilket understreger SAC’s betydning for etableringen af meiose I chekpoint20.
Som tidligere forskning tydeligt viser, kan DSB’er ikke inducere et robust profasekontrolpunkt i museoocytter. Hvis sådanne skader ikke repareres, kan det føre til, at embryoner bærer kromosomale abnormiteter. Derfor er det vigtigt at studere DNA-skaderesponsen på forskellige stadier af kvindelig gametogenese for bedre at forstå de unikke veje, som oocytter bruger til at klare potentielle genetiske fornærmelser.
Ved at bruge metoden beskrevet her påviste vi DSB’er i pattedyrs oocytter. Denne metode muliggør påvisning og undersøgelse af DNA-reparationsprocessen i oocytter. Den samme protokol kan også bruges til analyse af andre proteiner, der deltager i fysiologiske processer i pattedyrs oocytter. Det er vigtigt at undersøge, hvordan oocytter reagerer på potentielle DNA-skader for bedre at forstå årsagen til kvindelig subfertilitet hos mennesker.
At studere DNA-skaderesponsen i pattedyrs oocytter kan være udfordrende på grund af oocytternes følsomhed. Oocythåndtering kræver specifikke temperaturer og CO 2 og O2 koncentrationer. Samtidig skal oocytterne beskyttes mod lys. Håndtering bør ske ved hjælp af glaspipetter, der ikke er for smalle, da dette kan være skadeligt for oocytterne, men heller ikke for bredt, da dette kan forårsage fortynding af mediet og dermed påvirke fikseringsproceduren negativt. I hvert trin af fiksering anvendes flere dråber buffere for at minimere fortyndingseffekten. En alternativ måde at observere DSB’er på er Comet-assayet24. Selvom denne teknik er mere følsom, er den mere kompliceret. Samtidig er det ved hjælp af kometanalysen ikke muligt at detektere det nøjagtige DNA-område, hvor skaden opstår, og i celler med rigelige RNA-molekyler, som GV-trinoocytter25, kan baggrunden øges, hvilket fører til et falsk DNA-skadesignal26.
Ved at bruge immunfluorescensprotokollen, der er beskrevet her, kan vi detektere DSB’er med nøjagtighed og estimere reparationsforløbet i GV-trins oocytter, som angivet ved reduktionen i γH2AX-fluorescens over tid. Ikke desto mindre er en begrænsning ved denne metode, at visse antistoffer kan præsentere uspecifik fordeling gennem ooplasmaet, hvilket fører til billeder med høj baggrundsfluorescens. PFA-Tx-100-bufferen bruges i stedet for sekventiel PFA og Tx-100, da vi har observeret, at den forbedrer fikseringsprocessen ved at tillade påvisning af mindre baggrund og ikke-specifik fluorescens. En anden begrænsning ved at bruge γH2AX til DSB-detektion er, at skader ikke kan estimeres efter GVBD på grund af den spontane phosphorylering af γH2AX i meiose23.
I denne immunofluorescensprotokol forbliver oocytterne i en væskebuffer og kan ikke opbevares i dias. Denne kendsgerning gør det vanskeligt at bevare de faste celler i dage efter tilsætningen af det sekundære antistof. For at opnå billeder af god kvalitet og ikke miste signal, foretrækkes det at udføre billeddannelsen inden for få timer efter tilsætning af det sekundære antistof. Det skal også bemærkes, at scanningen af kernerne gennem Z-aksen kan få signalet til at blive svagere på grund af overeksponering. Af den grund foretrækkes det at sænke lasereffekten og øge scanningshastigheden.
Endelig er en anden begrænsning af immunofluorescensprotokollen, at den kun kan bruges til faste / ikke-levende celler. Derfor kan vi kun estimere tilstedeværelsen og fraværet af faktorer på bestemte tidspunkter uden at vide, om der er udsving i deres koncentration eller ændringer i deres adfærd gennem tiden. Dette problem kan løses ved hjælp af levende cellebilleddannelse og fluorescerende mærkede markører.
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkender støtte til dette arbejde fra projektet “Etablering af kapacitetsopbygningsinfrastrukturer inden for biomedicinsk forskning (BIOMED-20)” (MIS 5047236), som gennemføres under aktionen “Styrkelse af forsknings- og innovationsinfrastrukturen”, finansieret af det operationelle program “Konkurrenceevne, iværksætteri og innovation” (NSRF 2014-2020) og medfinansieret af Grækenland og Den Europæiske Union (Den Europæiske Fond for Regionaludvikling).
3 mL Pasteur pipettes in LDPE, graduated | APTACA | 1502 | |
10 cc syringes | SoftCare | 114.104.21 | |
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit Secondary Ab | Biotium | 20012 | |
Anti-phospho-H2A.X (Ser139) | Merck Millipore | 07-164 | |
ARE Heating Magnetic Stirrer | VELP Scientifica | F20500162 | |
BD FALCON 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tubes | BD Biosciences | 352054 | |
BD Microlance 3 Needles 27 G – 0.40 x 13 mm | Becton Dickinson | 300635 | |
Bovine Serum Albumin Fraction V | Roche | 10735078001 | |
DMSO Anhydrous | Biotium | 90082 | |
DRAQ7 DNA dye | BioStatus | DR71000 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E4378-25G | |
EMSURE MgCl2. 6H2O | Merck Millipore | 1058330250 | |
Etoposide | CHEMIPHARM | L01CB01 | |
FALCON 14 mL Polystyrene Round-Bottom Tubes | Corning Science | 532057 | |
FALCON Tissue Culture Dishes, Easy-Grip, 35 x 10 mm Style | Corning Science | 353001 | |
Glass Bottom Culture Dishes (35 mm Petri dish/ 14 mm Microwell, No. 0 coverglass) | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H6147-25G | |
HERACELL 150i CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | 50116048 | |
IBMX powder | Sigma-Aldrich | I5879-100MG | |
Leica M125 Stereo Microscope | Leica Microsystems | ||
M16 Medium | Sigma-Aldrich | M7292 | |
M2 Medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5310 | |
NaN3 | Honeywell | 13412H | |
NaOH | Merck Millipore | 1064981000 | |
Nikon AX ECLIPSE Ti2 Confocal Microscope | Nikon Corporation | ||
Nikon SMZ800N Stereo Microscope | Nikon Corporation | ||
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
Pasteur pippettes, glass, long form 230 mm | DURAN WHEATON KIMBLE | 357335 | |
pH/ORP meter | Hanna Instruments Ltd | HI2211 | |
Phosphate buffered saline tablets | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
PIPES | Sigma-Aldrich | P1851 | |
PMSG Protein Lyophilised | Genway Biotech (now AVIVA Systems Biology) | GWB-2AE30A (now OPPA01037) | |
QBD4 Dry block heater | Grant Instruments (Cambridge) Ltd | A25218 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
Whatman Puradisc 25 mm 0.2 μm filters | GE Healthcare | 6780-2502 |