Nous présentons ici un protocole qui permet une fabrication rapide, robuste et peu coûteuse de sphéroïdes tumoraux, suivie d’une encapsulation d’hydrogel. Il est largement applicable car il ne nécessite pas d’équipement spécialisé. Il serait particulièrement utile pour explorer les interactions sphéroïde-matrice et construire des modèles de physiologie tissulaire ou de pathologie in vitro .
L’encapsulation tridimensionnelle (3D) des sphéroïdes est cruciale pour reproduire correctement le microenvironnement tumoral pour une croissance cellulaire optimale. Ici, nous avons conçu un modèle de glioblastome 3D in vitro pour l’encapsulation de sphéroïdes afin d’imiter le microenvironnement extracellulaire de la tumeur. Tout d’abord, nous avons formé des moules pyramidaux carrés à micropuits en utilisant du polydiméthylsiloxane. Ces moules à micropuits ont ensuite été utilisés pour fabriquer des sphéroïdes tumoraux avec des tailles étroitement contrôlées de 50 à 500 μm. Une fois les sphéroïdes formés, ils ont été récoltés et encapsulés dans des hydrogels à base de polyéthylène glycol (PEG). Les hydrogels PEG constituent une plate-forme polyvalente pour l’encapsulation de sphéroïdes, car les propriétés de l’hydrogel telles que la rigidité, la dégradabilité et l’adhérence cellulaire peuvent être ajustées indépendamment. Ici, nous avons utilisé un hydrogel souple représentatif (~8 kPa) pour encapsuler les sphéroïdes de glioblastome. Enfin, une méthode de coloration et d’imagerie des sphéroïdes a été développée pour obtenir des images de haute qualité par microscopie confocale. En raison du noyau sphéroïde dense et de la périphérie relativement clairsemée, l’imagerie peut être difficile, mais l’utilisation d’une solution de dégagement et d’un sectionnement optique confocal permet d’atténuer ces difficultés d’imagerie. En résumé, nous montrons une méthode pour fabriquer des sphéroïdes uniformes, les encapsuler dans des hydrogels PEG et effectuer une microscopie confocale sur les sphéroïdes encapsulés pour étudier la croissance des sphéroïdes et diverses interactions cellule-matrice.
Les sphéroïdes tumoraux sont apparus comme des outils in vitro utiles dans l’étude de l’étiologie du cancer, de la pathologie et de la réponse aux médicaments1. Traditionnellement, les sphéroïdes ont été cultivés dans des conditions telles que des plaques à faible adhérence ou des bioréacteurs, où l’adhésion cellule-cellule est privilégiée par rapport à l’adhésion cellule-surface2. Cependant, il est maintenant reconnu que pour récapituler plus fidèlement le microenvironnement tumoral, les modèles sphéroïdes in vitro devraient capturer à la fois les interactions cellule-cellule et cellule-matrice. Cela a incité plusieurs groupes à concevoir des échafaudages, tels que des hydrogels, où les sphéroïdes peuvent être encapsulés 3,4. De tels modèles de sphéroïdes à base d’hydrogel permettent d’élucider les interactions cellule-cellule et cellule-matrice sur divers comportements cellulaires, tels que la viabilité, la prolifération, la souche ou la réactivité thérapeutique3.
Ici, nous décrivons un protocole pour l’encapsulation de sphéroïdes de glioblastome dans des hydrogels de polyéthylène glycol (PEG). Il existe de nombreux rapports de littérature sur l’encapsulation de sphéroïdes de cellules de glioblastome dans des hydrogels. Par exemple, les sphéroïdes ont été formés en encapsulant des cellules U87 dans des hydrogels PEG décorés d’un ligand adhésif RGDS et réticulés avec un peptide clivable enzymatiquement pour déterminer l’effet de la rigidité de l’hydrogel sur le comportement cellulaire5. Des cellules U87 ont également été formées dans d’autres hydrogels à base de PEG ou d’acide hyaluronique pour élargir la population de cellules souches cancéreuses6 ou pour explorer les mécanismes de résistance à la chimiothérapiemédiés par la matrice 7,8,9. Les sphéroïdes de glioblastome ont également été encapsulés dans des hydrogels de gélatine pour étudier l’interaction entre la microglie et les cellules cancéreuses et son effet sur l’invasion cellulaire10. Dans l’ensemble, ces études ont démontré l’utilité des modèles in vitro à base d’hydrogel pour comprendre la pathologie du glioblastome et concevoir des traitements.
De plus, il existe différentes méthodes de fabrication de sphéroïdes tumoraux et d’encapsulation d’hydrogel11. Par exemple, les cellules dispersées pourraient être ensemencées dans des hydrogels et autorisées à former des sphéroïdes au fil du temps 5,12. Un inconvénient d’une telle méthode est la polydispersité des sphéroïdes formés, ce qui pourrait conduire à des réponses cellulaires différentielles. Pour produire des sphéroïdes uniformes, les cellules pourraient être encapsulées dans des microgels et cultivées pendant de longues périodes jusqu’à ce qu’elles envahissent et remodèlent le gel13, ou les cellules pourraient être déposées dans des gels matriciels avec des « trous » sphériques et autorisées à s’agréger14. L’inconvénient de ces méthodes est leur relative complexité, la nécessité d’un générateur de gouttelettes ou d’autres moyens pour former des microgels ou des « trous » dans le gel, et le temps nécessaire aux sphéroïdes pour croître et mûrir. Alternativement, les sphéroïdes pourraient être préformés dans des micropuits 9,15,16 ou dans des plaques suspendues 17,18, puis encapsulés dans un hydrogel, similaire à la technique décrite ici. Ces méthodes sont plus simples et peuvent être effectuées à un débit plus élevé. Il est intéressant de noter qu’il a été démontré que la méthode de formation des sphéroïdes peut affecter les comportements des cellules sphéroïdes, tels que l’expression des gènes, la prolifération cellulaire ou la réponse aux médicaments19,20.
Ici, nous nous concentrons sur le glioblastome car il s’agit d’une tumeur solide dont l’environnement natif est la matrice cérébrale molle et nanoporeuse21, qui peut être imitée par un hydrogel mou et nanoporeux. Le glioblastome est également le cancer du cerveau le plus mortel pour lequel il n’existe aucun remède22. Cependant, le protocole décrit ici peut être utilisé pour l’encapsulation de sphéroïdes représentant toute tumeur solide. Nous avons choisi d’utiliser des hydrogels PEG qui sont formés par une réaction d’addition de type Michael23. Le PEG est un hydrogel synthétique, non dégradable et biocompatible qui est inerte et sert d’échafaudage et de support cellulaire physique, mais ne supporte pas la fixation des cellules23. L’adhérence cellulaire peut être ajoutée séparément par attache de protéines entières ou de ligands adhésifs24, et la dégradabilité peut être ajoutée par des modifications chimiques de la chaîne polymère PEG ou des réticulants hydrolytiques ou enzymatiquement dégradables25,26. Cela permet d’ajuster les propriétés biochimiques indépendamment des propriétés mécaniques ou physiques de l’hydrogel, ce qui pourrait être avantageux pour étudier les interactions cellule-matrice. La chimie de gélification de type Michael est sélective et se produit dans des conditions physiologiques ; par conséquent, il permet l’encapsulation des sphéroïdes en mélangeant simplement les sphéroïdes avec la solution de précurseur de l’hydrogel.
Dans l’ensemble, la méthodologie présentée ici présente plusieurs caractéristiques notables. Tout d’abord, la fabrication de sphéroïdes tumoraux dans un assemblage multipuits est efficace, rapide et le coût des matériaux nécessaires est faible. Deuxièmement, les sphéroïdes sont produits en grandes quantités dans une variété de tailles avec une faible polydispersité. Enfin, seuls les matériaux disponibles dans le commerce sont nécessaires. L’utilité de la méthodologie est illustrée par l’exploration de l’effet des propriétés du substrat sur la viabilité, la circularité et la souche cellulaire des cellules sphéroïdes.
Des modèles de sphéroïdes tumoraux multicellulaires à base d’hydrogel sont de plus en plus développés pour faire progresser les découvertes thérapeutiques contre le cancer 11,13,29. Ils sont bénéfiques car ils émulent les paramètres clés du microenvironnement tumoral de manière contrôlée et, malgré leur complexité, sont plus simples et moins chers à utiliser que les modèles in vivo, et beaucoup sont compati…
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été financé par des fonds de démarrage fournis au Dr Silviya P Zustiak par l’Université de Saint Louis ainsi que par une subvention de démarrage du Henry and Amelia Nasrallah Center for Neuroscience de l’Université de Saint Louis accordée au Dr Silviya P Zustiak.
70% Ethanol | Fisher Scientific | LC22210-4 | |
15 mL Conicals | FALCON | 352097 | |
24-Well Plate Ultra Low Attachment plates | Fisher Scientific | 07-200-602 | |
35 mm Petri Dish | Amazon | 706011 | |
4-arm poly(ethylene glycol)-acrylate (4-arm PEG-Ac; 10 kDa) | Laysan Bio | ACRL-PEG-ACRL-10K-5g | |
50 mL Conicals | Fisher Scinetific | 3181345107 | |
6-well AggreWell 400 | StemCell Technologies, Vancouver, Canada | 34421 | Square pyramidal microwells |
anti-adherence rinsing solution | StemCell Technologies, Vancouver, Canada | Cat #: 07010 | |
Aspartic Acid-Arginine-Cysteine-Glycine-Valine-Proline-Methionine-Serine-Methionine-Arginine-Glycine-Cysteine-Arginine- Aspartic Acid (DRCG-VPMSMR-GCRD) peptide | Genic Bio, Shanghai, China | n/a | Custom synthesis |
Chemical Fume Hood | KEWAUNEE | 99151 | |
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV Free | Corning | 356234 | Basement membrane matrix |
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) | Thermo Scientific | 62247 | |
Detergent – Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | Nonionic surfactant |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | |
Disposable Pipettes (1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL) | Fisher Scinetific | 1 mL: 13-678-11B, 2mL: 05214038, 5mL(FALCON): 357529, 10mL: 13-678-11E, 25mL: 13-678-11, 50mL: 13-678-11F | |
Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30073-03 | |
Formaldehyde 37% Solution | Sigma Aldrich | F1635 | |
Glass Plates | Slumpys | GBS4100SFSL | |
Glass Transfer Pipettes | Fisher Scinetific | 5 3/4": 1367820A, 9":136786B | |
Glycine-Arginine-Cysteine-Aspartic Acid-Arginine-Glycine-Aspartic Acid-Serine (GRCD-RGDS) peptide | Genic Bio, Shanghai, China | n/a | Custom synthesis |
Hemacytometer | Bright-Line | 383684 | |
Hydrophobic solution – Repel Silane | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-1332-01 | |
Incubator | NUAIRE | NU-8500 | |
Inverted Microscope (Axiovert 25) | Zeiss | 663526 | |
Invitrogen DiOC16(3) (3,3'-Dihexadecyloxacarbocyanine Perchlorate) | Fisher Scientific | D1125 | |
Leica Confocal SP8 | Leica Microsystems Inc. | ||
Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M) | Zeiss | 3820005619 | |
Micro centrifuge tubes | Fisher Scientific | 2 mL: 02681258 | |
Microscope Software | Zeiss | AxioVision Rel. 4.8.2 | |
Nestin Alexa Fluor 594 | Santa Cruz Biotechnology | sc-23927 | |
Parafilm | PARAFILM | PM992 | |
PBS (1x), pH 7.4 | HyClone | SH30256.01 | |
Penicillin Streptomycin | MP Biomedicals | 1670046 | |
Pipette Aid | Drummond Scientific Co. | P-76864 | |
Pipette Tips (1–200 µL, 101–1000 µL) | Fisher Scinetific | 2707509 | |
Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9D | |
Plastic Weigh Boats (100 mL) | Amazon | mdo-azoc-1030 | |
poly(ethylene glycol)-dithiol (PEG-diSH; 3.4 kDa) | Laysan Bio | SH-PEG-SH-3400-5g | |
Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit] | Elsworth Adhesives | 3097358-1004 | Polydimethylsiloxane |
Powder Free Examination Gloves | Quest | 92897 | |
Propidium iodide, 1 mg/mL aqueous soln. | Fisher Scientific | AAJ66584AB | |
RPMI-1640 Medium (1x) | HyClone | SH30027-02 | |
Silicone spacers – Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm | Grace Bio-Labs | JTR-S-0.5 | |
SOX2 Alexa Fluor 488 | Santa Cruz Biotechnology | sc-365823 | |
Tissue Culture Hood | NUAIRE | NU-425-600 | |
Triethanolamine, ≥99.0% (GC) | Sigma Aldrich | 90279 | |
Trypsin 0.25% (1x) | Sigma Aldrich | SH30042.01 | |
U-87 MG human glioblastoma cells | American Type Culture Collection | HTB-14 |