Summary

Fabricação e encapsulamento de esferoides tumorais em hidrogéis de polietilenoglicol para estudo de interações esferóide-matriz

Published: September 22, 2023
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Summary

Aqui, apresentamos um protocolo que permite a fabricação rápida, robusta e barata de esferoides tumorais seguida de encapsulamento em hidrogel. É amplamente aplicável, pois não requer equipamentos especializados. Seria particularmente útil para explorar interações matriz-esferóide e construir modelos in vitro de fisiologia ou patologia tecidual.

Abstract

O encapsulamento tridimensional (3D) de esferoides é crucial para replicar adequadamente o microambiente tumoral para um ótimo crescimento celular. Aqui, projetamos um modelo in vitro de glioblastoma 3D para encapsulamento esferoide para mimetizar o microambiente extracelular tumoral. Primeiro, formamos moldes de micropoços piramidais quadrados usando polidimetilsiloxano. Esses moldes de micropoços foram então usados para fabricar esferoides tumorais com tamanhos rigidamente controlados de 50-500 μm. Uma vez formados, os esferoides foram colhidos e encapsulados em hidrogéis à base de polietilenoglicol (PEG). Os hidrogéis de PEG são uma plataforma versátil para encapsulamento esferoide, pois as propriedades do hidrogel, como rigidez, degradabilidade e adesividade celular, podem ser ajustadas independentemente. Aqui, usamos um hidrogel macio representativo (~8 kPa) para encapsular esferoides de glioblastoma. Finalmente, um método para coloração e imagem de esferoides foi desenvolvido para obter imagens de alta qualidade via microscopia confocal. Devido ao núcleo esferoide denso e à periferia relativamente escassa, a obtenção de imagens pode ser difícil, mas o uso de uma solução de clareamento e corte óptico confocal ajuda a aliviar essas dificuldades de imagem. Em resumo, mostramos um método para fabricar esferoides uniformes, encapsula-los em hidrogéis de PEG e realizar microscopia confocal nos esferoides encapsulados para estudar o crescimento esferoide e várias interações célula-matriz.

Introduction

Os esferoides tumorais têm emergido como ferramentas úteis in vitro no estudo da etiologia, patologia e responsividade a drogasdo câncer 1. Tradicionalmente, esferoides têm sido cultivados em condições como placas de baixa adesão ou biorreatores, onde a adesão célula-célula é favorecida em relação à adesão célula-superfície2. No entanto, é hoje reconhecido que, para recapitular o microambiente tumoral com mais fidelidade, modelos esferoides in vitro devem capturar tanto as interações célula-célula quanto célula-matriz. Isso levou vários grupos a projetar arcabouços, como hidrogéis, onde esferoides podem ser encapsulados 3,4. Tais modelos esferoides baseados em hidrogel permitem a elucidação de interações célula-célula e célula-matriz sobre vários comportamentos celulares, tais como viabilidade, proliferação, tronco ou responsividade à terapia3.

Aqui, descrevemos um protocolo para encapsulação de esferoides de glioblastoma em hidrogéis de polietilenoglicol (PEG). Existem vários relatos na literatura de encapsulamento esferoide de células de glioblastoma em hidrogéis. Por exemplo, esferoides foram formados encapsulando células U87 em hidrogéis de PEG decorados com um ligante adesivo RGDS e reticulados com um peptídeo enzimaticamente clivável para determinar o efeito da rigidez do hidrogel no comportamento celular5. Células U87 também foram formadas em outros hidrogéis à base de PEG ou ácido hialurônico para expandir a população de células-tronco cancerígenas6 ou explorar mecanismos mediados pela matriz de resistência à quimioterapia 7,8,9. Esferoides de glioblastoma também têm sido encapsulados em hidrogéis de gelatina para estudar o crosstalk entre micróglia e células cancerosas e seu efeito na invasão celular10. Em geral, tais estudos têm demonstrado a utilidade de modelos in vitro baseados em hidrogel na compreensão da patologia do glioblastoma e na elaboração de tratamentos.

Além disso, existem diferentes métodos para a fabricação de esferoides tumorais e encapsulamento de hidrogel11. Por exemplo, células dispersas poderiam ser semeadas em hidrogéis e deixadas formar esferoides ao longo do tempo 5,12. Uma desvantagem de tal método é a polidispersidade dos esferoides formados, o que poderia levar a respostas celulares diferenciais. Para produzir esferoides uniformes, as células poderiam ser encapsuladas em microgéis e cultivadas por longos períodos até invadirem e remodelarem o gel13, ou as células poderiam ser depositadas em géis moldados com “furos” esféricos e deixadas agregar14. A desvantagem desses métodos é sua relativa complexidade, a necessidade de um gerador de gotículas ou outros meios para formar microgéis ou os “buracos” no gel, e o tempo que leva para os esferoides crescerem e amadurecerem. Alternativamente, os esferoides poderiam ser pré-formados em micropoços 9,15,16 ou em placas suspensas17,18 e então encapsulados em hidrogel, semelhante à técnica aqui descrita. Esses métodos são mais simples e podem ser feitos de uma forma de maior rendimento. Curiosamente, tem sido demonstrado que o método de formação de esferoides pode afetar comportamentos de células esferoides, tais como expressão gênica, proliferação celular ou responsividade a drogas19,20.

Aqui, enfocamos o glioblastoma por se tratar de um tumor sólido cujo ambiente nativo é a matriz cerebral macia e nanoporosa21, que pode ser mimetizada por um hidrogel macio e nanoporoso. O glioblastoma também é o câncer cerebral mais letal para o qual não há cura disponível22. Entretanto, o protocolo aqui descrito pode ser utilizado para o encapsulamento de esferoides representando qualquer tumor sólido. Optou-se por utilizar hidrogéis de PEG que são formados através de uma reação de adição tipo Michael23. O PEG é um hidrogel sintético, não degradável e biocompatível, inerte e serve como andaime e suporte físico celular, mas não suporta a ligação celular23. A adesividade celular pode ser adicionada separadamente via amarração de proteínas inteiras ou ligantes adesivos24, e a degradabilidade pode ser adicionada através de modificações químicas da cadeia polimérica do PEG ou reticulantes hidrolítica ou enzimaticamente degradáveis25,26. Isso permite que as propriedades bioquímicas sejam ajustadas independentemente das propriedades mecânicas ou físicas do hidrogel, o que poderia ser vantajoso no estudo das interações célula-matriz. A química de gelificação do tipo Michael é seletiva e ocorre em condições fisiológicas; Assim, permite o encapsulamento esferoide simplesmente misturando os esferoides com a solução precursora de hidrogel.

De modo geral, a metodologia aqui apresentada tem várias características notáveis. Primeiro, fabricar esferoides tumorais em uma montagem multipoço é eficiente, rápido e o custo dos materiais necessários é baixo. Em segundo lugar, os esferoides são produzidos em grandes lotes em uma variedade de tamanhos com baixa polidispersidade. Finalmente, apenas materiais disponíveis comercialmente são necessários. A utilidade da metodologia é ilustrada pela exploração do efeito das propriedades do substrato na viabilidade das células esferoides, circularidade e tronco celular.

Protocol

1. Preparação das soluções Preparação de solução precursora de polidimetilsiloxano (PDMS)Preparar a solução precursora negativa de PDMS (também usada para a solução de precursor de cola). Coloque o elastômero em um barco de pesagem usando uma espátula e pese-o. Adicione o agente de cura à base do elastômero na proporção de 1:10. Misture o PDMS e o agente de cura suave e cuidadosamente usando a espátula no barco de pesagem de plástico.NOTA: Esta solução precurs…

Representative Results

Plataformas de triagem de fármacos baseadas em esferoides para estudar os efeitos quimioterápicos são cada vez mais procuradas devido à ênfase na modulação do microambiente tumoral sobre o encapsulamento esferoide em biomateriais replicantes de tecido nativo. Aqui desenvolvemos um método para preparação de esferoides tumorais multicelulares e posterior encapsulamento e imageamento em hidrogel 3D. Os esferoides são preparados em moldes de micropoços (Figura 3A,B), que resultam em …

Discussion

Modelos esferoides tumorais multicelulares baseados em hidrogel estão sendo cada vez mais desenvolvidos para avançar nas descobertas terapêuticas do câncer11,13,29. Eles são benéficos porque emulam parâmetros-chave do microambiente tumoral de forma controlada e, apesar de sua complexidade, são mais simples e baratos de usar do que os modelos in vivo, e muitos são compatíveis com tecnologias de rastreamento de alto rend…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado por fundos iniciais fornecidos à Dra. Silviya P Zustiak pela Saint Louis University, bem como por uma bolsa semente do Henry and Amelia Nasrallah Center for Neuroscience da Saint Louis University concedida à Dra. Silviya P Zustiak.

Materials

70% Ethanol Fisher Scientific  LC22210-4
15 mL Conicals FALCON 352097
24-Well Plate Ultra Low Attachment plates Fisher Scientific 07-200-602
35 mm Petri Dish Amazon 706011
4-arm poly(ethylene glycol)-acrylate (4-arm PEG-Ac; 10 kDa) Laysan Bio ACRL-PEG-ACRL-10K-5g
50 mL Conicals Fisher Scinetific 3181345107
6-well AggreWell 400  StemCell Technologies, Vancouver, Canada 34421 Square pyramidal microwells 
anti-adherence rinsing solution StemCell Technologies, Vancouver, Canada Cat #: 07010
Aspartic Acid-Arginine-Cysteine-Glycine-Valine-Proline-Methionine-Serine-Methionine-Arginine-Glycine-Cysteine-Arginine- Aspartic Acid (DRCG-VPMSMR-GCRD) peptide Genic Bio, Shanghai, China n/a Custom synthesis
Chemical Fume Hood KEWAUNEE 99151
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV Free  Corning 356234 Basement membrane matrix
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) Thermo Scientific 62247
Detergent – Triton-X Sigma Aldrich T8787 Nonionic surfactant
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific  BP231-100
Disposable Pipettes (1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL) Fisher Scinetific 1 mL: 13-678-11B, 2mL: 05214038, 5mL(FALCON): 357529, 10mL: 13-678-11E, 25mL: 13-678-11, 50mL: 13-678-11F
Fetal Bovine Serum HyClone SH30073-03
Formaldehyde 37% Solution Sigma Aldrich F1635
Glass Plates Slumpys GBS4100SFSL
Glass Transfer Pipettes Fisher Scinetific 5 3/4": 1367820A, 9":136786B
Glycine-Arginine-Cysteine-Aspartic Acid-Arginine-Glycine-Aspartic Acid-Serine (GRCD-RGDS) peptide Genic Bio, Shanghai, China n/a Custom synthesis
Hemacytometer Bright-Line 383684
Hydrophobic solution – Repel Silane  GE Healthcare Bio-Sciences 17-1332-01
Incubator NUAIRE NU-8500
Inverted Microscope (Axiovert 25) Zeiss 663526
Invitrogen DiOC16(3) (3,3'-Dihexadecyloxacarbocyanine Perchlorate) Fisher Scientific  D1125
Leica Confocal SP8 Leica Microsystems Inc.
Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M) Zeiss 3820005619
Micro centrifuge tubes Fisher Scientific 2 mL: 02681258
Microscope Software Zeiss AxioVision Rel. 4.8.2
Nestin Alexa Fluor 594  Santa Cruz Biotechnology sc-23927
Parafilm PARAFILM  PM992
PBS (1x), pH 7.4 HyClone SH30256.01
Penicillin Streptomycin MP Biomedicals 1670046
Pipette Aid Drummond Scientific Co. P-76864
Pipette Tips (1–200 µL, 101–1000 µL) Fisher Scinetific 2707509
Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes Fisher Scientific 13-711-9D
Plastic Weigh Boats (100 mL) Amazon  mdo-azoc-1030
poly(ethylene glycol)-dithiol (PEG-diSH; 3.4 kDa) Laysan Bio SH-PEG-SH-3400-5g
Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit] Elsworth Adhesives 3097358-1004 Polydimethylsiloxane
Powder Free Examination Gloves Quest 92897
Propidium iodide, 1 mg/mL aqueous soln.  Fisher Scientific  AAJ66584AB
RPMI-1640 Medium (1x) HyClone SH30027-02
Silicone spacers – Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm Grace Bio-Labs JTR-S-0.5
SOX2 Alexa Fluor 488  Santa Cruz Biotechnology sc-365823
Tissue Culture Hood NUAIRE NU-425-600
Triethanolamine, ≥99.0% (GC)  Sigma Aldrich 90279
Trypsin 0.25% (1x)  Sigma Aldrich SH30042.01
U-87 MG human glioblastoma cells American Type Culture Collection  HTB-14

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Cite This Article
Bruns, J., Nejat, S., Faber, A., Zustiak, S. P. Tumor Spheroid Fabrication and Encapsulation in Polyethylene Glycol Hydrogels for Studying Spheroid-Matrix Interactions. J. Vis. Exp. (199), e65515, doi:10.3791/65515 (2023).

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