Aqui, apresentamos um protocolo que permite a fabricação rápida, robusta e barata de esferoides tumorais seguida de encapsulamento em hidrogel. É amplamente aplicável, pois não requer equipamentos especializados. Seria particularmente útil para explorar interações matriz-esferóide e construir modelos in vitro de fisiologia ou patologia tecidual.
O encapsulamento tridimensional (3D) de esferoides é crucial para replicar adequadamente o microambiente tumoral para um ótimo crescimento celular. Aqui, projetamos um modelo in vitro de glioblastoma 3D para encapsulamento esferoide para mimetizar o microambiente extracelular tumoral. Primeiro, formamos moldes de micropoços piramidais quadrados usando polidimetilsiloxano. Esses moldes de micropoços foram então usados para fabricar esferoides tumorais com tamanhos rigidamente controlados de 50-500 μm. Uma vez formados, os esferoides foram colhidos e encapsulados em hidrogéis à base de polietilenoglicol (PEG). Os hidrogéis de PEG são uma plataforma versátil para encapsulamento esferoide, pois as propriedades do hidrogel, como rigidez, degradabilidade e adesividade celular, podem ser ajustadas independentemente. Aqui, usamos um hidrogel macio representativo (~8 kPa) para encapsular esferoides de glioblastoma. Finalmente, um método para coloração e imagem de esferoides foi desenvolvido para obter imagens de alta qualidade via microscopia confocal. Devido ao núcleo esferoide denso e à periferia relativamente escassa, a obtenção de imagens pode ser difícil, mas o uso de uma solução de clareamento e corte óptico confocal ajuda a aliviar essas dificuldades de imagem. Em resumo, mostramos um método para fabricar esferoides uniformes, encapsula-los em hidrogéis de PEG e realizar microscopia confocal nos esferoides encapsulados para estudar o crescimento esferoide e várias interações célula-matriz.
Os esferoides tumorais têm emergido como ferramentas úteis in vitro no estudo da etiologia, patologia e responsividade a drogasdo câncer 1. Tradicionalmente, esferoides têm sido cultivados em condições como placas de baixa adesão ou biorreatores, onde a adesão célula-célula é favorecida em relação à adesão célula-superfície2. No entanto, é hoje reconhecido que, para recapitular o microambiente tumoral com mais fidelidade, modelos esferoides in vitro devem capturar tanto as interações célula-célula quanto célula-matriz. Isso levou vários grupos a projetar arcabouços, como hidrogéis, onde esferoides podem ser encapsulados 3,4. Tais modelos esferoides baseados em hidrogel permitem a elucidação de interações célula-célula e célula-matriz sobre vários comportamentos celulares, tais como viabilidade, proliferação, tronco ou responsividade à terapia3.
Aqui, descrevemos um protocolo para encapsulação de esferoides de glioblastoma em hidrogéis de polietilenoglicol (PEG). Existem vários relatos na literatura de encapsulamento esferoide de células de glioblastoma em hidrogéis. Por exemplo, esferoides foram formados encapsulando células U87 em hidrogéis de PEG decorados com um ligante adesivo RGDS e reticulados com um peptídeo enzimaticamente clivável para determinar o efeito da rigidez do hidrogel no comportamento celular5. Células U87 também foram formadas em outros hidrogéis à base de PEG ou ácido hialurônico para expandir a população de células-tronco cancerígenas6 ou explorar mecanismos mediados pela matriz de resistência à quimioterapia 7,8,9. Esferoides de glioblastoma também têm sido encapsulados em hidrogéis de gelatina para estudar o crosstalk entre micróglia e células cancerosas e seu efeito na invasão celular10. Em geral, tais estudos têm demonstrado a utilidade de modelos in vitro baseados em hidrogel na compreensão da patologia do glioblastoma e na elaboração de tratamentos.
Além disso, existem diferentes métodos para a fabricação de esferoides tumorais e encapsulamento de hidrogel11. Por exemplo, células dispersas poderiam ser semeadas em hidrogéis e deixadas formar esferoides ao longo do tempo 5,12. Uma desvantagem de tal método é a polidispersidade dos esferoides formados, o que poderia levar a respostas celulares diferenciais. Para produzir esferoides uniformes, as células poderiam ser encapsuladas em microgéis e cultivadas por longos períodos até invadirem e remodelarem o gel13, ou as células poderiam ser depositadas em géis moldados com “furos” esféricos e deixadas agregar14. A desvantagem desses métodos é sua relativa complexidade, a necessidade de um gerador de gotículas ou outros meios para formar microgéis ou os “buracos” no gel, e o tempo que leva para os esferoides crescerem e amadurecerem. Alternativamente, os esferoides poderiam ser pré-formados em micropoços 9,15,16 ou em placas suspensas17,18 e então encapsulados em hidrogel, semelhante à técnica aqui descrita. Esses métodos são mais simples e podem ser feitos de uma forma de maior rendimento. Curiosamente, tem sido demonstrado que o método de formação de esferoides pode afetar comportamentos de células esferoides, tais como expressão gênica, proliferação celular ou responsividade a drogas19,20.
Aqui, enfocamos o glioblastoma por se tratar de um tumor sólido cujo ambiente nativo é a matriz cerebral macia e nanoporosa21, que pode ser mimetizada por um hidrogel macio e nanoporoso. O glioblastoma também é o câncer cerebral mais letal para o qual não há cura disponível22. Entretanto, o protocolo aqui descrito pode ser utilizado para o encapsulamento de esferoides representando qualquer tumor sólido. Optou-se por utilizar hidrogéis de PEG que são formados através de uma reação de adição tipo Michael23. O PEG é um hidrogel sintético, não degradável e biocompatível, inerte e serve como andaime e suporte físico celular, mas não suporta a ligação celular23. A adesividade celular pode ser adicionada separadamente via amarração de proteínas inteiras ou ligantes adesivos24, e a degradabilidade pode ser adicionada através de modificações químicas da cadeia polimérica do PEG ou reticulantes hidrolítica ou enzimaticamente degradáveis25,26. Isso permite que as propriedades bioquímicas sejam ajustadas independentemente das propriedades mecânicas ou físicas do hidrogel, o que poderia ser vantajoso no estudo das interações célula-matriz. A química de gelificação do tipo Michael é seletiva e ocorre em condições fisiológicas; Assim, permite o encapsulamento esferoide simplesmente misturando os esferoides com a solução precursora de hidrogel.
De modo geral, a metodologia aqui apresentada tem várias características notáveis. Primeiro, fabricar esferoides tumorais em uma montagem multipoço é eficiente, rápido e o custo dos materiais necessários é baixo. Em segundo lugar, os esferoides são produzidos em grandes lotes em uma variedade de tamanhos com baixa polidispersidade. Finalmente, apenas materiais disponíveis comercialmente são necessários. A utilidade da metodologia é ilustrada pela exploração do efeito das propriedades do substrato na viabilidade das células esferoides, circularidade e tronco celular.
Modelos esferoides tumorais multicelulares baseados em hidrogel estão sendo cada vez mais desenvolvidos para avançar nas descobertas terapêuticas do câncer11,13,29. Eles são benéficos porque emulam parâmetros-chave do microambiente tumoral de forma controlada e, apesar de sua complexidade, são mais simples e baratos de usar do que os modelos in vivo, e muitos são compatíveis com tecnologias de rastreamento de alto rend…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado por fundos iniciais fornecidos à Dra. Silviya P Zustiak pela Saint Louis University, bem como por uma bolsa semente do Henry and Amelia Nasrallah Center for Neuroscience da Saint Louis University concedida à Dra. Silviya P Zustiak.
70% Ethanol | Fisher Scientific | LC22210-4 | |
15 mL Conicals | FALCON | 352097 | |
24-Well Plate Ultra Low Attachment plates | Fisher Scientific | 07-200-602 | |
35 mm Petri Dish | Amazon | 706011 | |
4-arm poly(ethylene glycol)-acrylate (4-arm PEG-Ac; 10 kDa) | Laysan Bio | ACRL-PEG-ACRL-10K-5g | |
50 mL Conicals | Fisher Scinetific | 3181345107 | |
6-well AggreWell 400 | StemCell Technologies, Vancouver, Canada | 34421 | Square pyramidal microwells |
anti-adherence rinsing solution | StemCell Technologies, Vancouver, Canada | Cat #: 07010 | |
Aspartic Acid-Arginine-Cysteine-Glycine-Valine-Proline-Methionine-Serine-Methionine-Arginine-Glycine-Cysteine-Arginine- Aspartic Acid (DRCG-VPMSMR-GCRD) peptide | Genic Bio, Shanghai, China | n/a | Custom synthesis |
Chemical Fume Hood | KEWAUNEE | 99151 | |
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV Free | Corning | 356234 | Basement membrane matrix |
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) | Thermo Scientific | 62247 | |
Detergent – Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | Nonionic surfactant |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | |
Disposable Pipettes (1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL) | Fisher Scinetific | 1 mL: 13-678-11B, 2mL: 05214038, 5mL(FALCON): 357529, 10mL: 13-678-11E, 25mL: 13-678-11, 50mL: 13-678-11F | |
Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30073-03 | |
Formaldehyde 37% Solution | Sigma Aldrich | F1635 | |
Glass Plates | Slumpys | GBS4100SFSL | |
Glass Transfer Pipettes | Fisher Scinetific | 5 3/4": 1367820A, 9":136786B | |
Glycine-Arginine-Cysteine-Aspartic Acid-Arginine-Glycine-Aspartic Acid-Serine (GRCD-RGDS) peptide | Genic Bio, Shanghai, China | n/a | Custom synthesis |
Hemacytometer | Bright-Line | 383684 | |
Hydrophobic solution – Repel Silane | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-1332-01 | |
Incubator | NUAIRE | NU-8500 | |
Inverted Microscope (Axiovert 25) | Zeiss | 663526 | |
Invitrogen DiOC16(3) (3,3'-Dihexadecyloxacarbocyanine Perchlorate) | Fisher Scientific | D1125 | |
Leica Confocal SP8 | Leica Microsystems Inc. | ||
Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M) | Zeiss | 3820005619 | |
Micro centrifuge tubes | Fisher Scientific | 2 mL: 02681258 | |
Microscope Software | Zeiss | AxioVision Rel. 4.8.2 | |
Nestin Alexa Fluor 594 | Santa Cruz Biotechnology | sc-23927 | |
Parafilm | PARAFILM | PM992 | |
PBS (1x), pH 7.4 | HyClone | SH30256.01 | |
Penicillin Streptomycin | MP Biomedicals | 1670046 | |
Pipette Aid | Drummond Scientific Co. | P-76864 | |
Pipette Tips (1–200 µL, 101–1000 µL) | Fisher Scinetific | 2707509 | |
Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9D | |
Plastic Weigh Boats (100 mL) | Amazon | mdo-azoc-1030 | |
poly(ethylene glycol)-dithiol (PEG-diSH; 3.4 kDa) | Laysan Bio | SH-PEG-SH-3400-5g | |
Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit] | Elsworth Adhesives | 3097358-1004 | Polydimethylsiloxane |
Powder Free Examination Gloves | Quest | 92897 | |
Propidium iodide, 1 mg/mL aqueous soln. | Fisher Scientific | AAJ66584AB | |
RPMI-1640 Medium (1x) | HyClone | SH30027-02 | |
Silicone spacers – Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm | Grace Bio-Labs | JTR-S-0.5 | |
SOX2 Alexa Fluor 488 | Santa Cruz Biotechnology | sc-365823 | |
Tissue Culture Hood | NUAIRE | NU-425-600 | |
Triethanolamine, ≥99.0% (GC) | Sigma Aldrich | 90279 | |
Trypsin 0.25% (1x) | Sigma Aldrich | SH30042.01 | |
U-87 MG human glioblastoma cells | American Type Culture Collection | HTB-14 |