Här diskuterar vi ett arbetsflöde för att förbereda, dissekera, montera och avbilda levande explanthjärnor från Drosophila melanogaster tredje instar larver för att observera den cellulära och subcellulära dynamiken under fysiologiska förhållanden.
Drosophila neurala stamceller (neuroblaster, NBs nedan) genomgår asymmetriska uppdelningar, regenererar den självförnyande neuroblasten, samtidigt som de bildar en differentierande ganglionmodercell (GMC), som kommer att genomgå ytterligare en delning för att ge upphov till två neuroner eller glia. Studier av NB har avslöjat de molekylära mekanismerna bakom cellpolaritet, spindelorientering, självförnyelse av neurala stamceller och differentiering. Dessa asymmetriska celldelningar är lätt observerbara via levande cellavbildning, vilket gör larvala NB idealiska för att undersöka den spatiotemporala dynamiken hos asymmetrisk celldelning i levande vävnad. När de är korrekt dissekerade och avbildade i näringskompletterat medium, delar NB i explanthjärnor robust i 12-20 timmar. Tidigare beskrivna metoder är tekniskt svåra och kan vara utmanande för dem som är nya inom området. Här beskrivs ett protokoll för beredning, dissektion, montering och avbildning av levande tredje instar larvala hjärnexplantat med hjälp av fettkroppstillskott. Potentiella problem diskuteras också, och exempel ges på hur denna teknik kan användas.
Asymmetrisk celldelning (ACD) är den process genom vilken subcellulära komponenter såsom RNA, proteiner och organeller delas ojämnt mellan dotterceller 1,2. Denna process ses ofta i stamceller, som genomgår ACD för att ge upphov till dotterceller med olika utvecklingsöden. Drosophila NB delar sig asymmetriskt för att producera en NB, som behåller sin stamhet, och en ganglionmodercell (GMC). GMC genomgår ytterligare uppdelningar för att producera differentierande neuroner eller glia3. Asymmetriskt delande NB är rikligt förekommande i de utvecklande hjärnorna hos larver från tredje instar, som lätt observeras via mikroskopi. Vid det tredje larvstadiet finns det ungefär 100 NB närvarande i varje central hjärnlob 3,4,5,6.
Asymmetrisk celldelning är en mycket dynamisk process. Live-cell imaging protokoll har använts för att mäta och kvantifiera dynamiken i cellpolaritet 7,8,9,10, spindelorientering11,12,13, dynamiken i aktomyosin cortex14,15,16,17,18, mikrotubuli och centrosombiologi 19,20,21,22,23,24,25,26,27 och membran 10,28 och kromatindynamik 29. Kvalitativa och kvantitativa beskrivningar av ACD bygger på robusta metoder och protokoll för att avbilda uppdelning av NB i intakta levande hjärnor. Följande protokoll beskriver metoder för att förbereda, dissekera och avbilda larvhjärnor från tredje instar för avbildning av levande celler in vivo med hjälp av två olika monteringsmetoder. Dessa metoder passar bäst för forskare som är intresserade av den spatiotemporala dynamiken i stamcellsdelningar, liksom delningar i andra hjärnceller, eftersom de möjliggör kort- och långsiktiga observationer av cellulära händelser. Dessutom är dessa tekniker lättillgängliga för nykomlingar på fältet. Vi demonstrerar effektiviteten och anpassningsförmågan hos detta tillvägagångssätt med larvhjärnor som uttrycker fluorescerande märkt mikrotubuli och kortikala fusionsproteiner. Vi diskuterar dessutom analysmetoder och överväganden för tillämpning i andra studier.
Detta protokoll beskriver ett tillvägagångssätt för avbildning av levande explanthjärnor från Drosophila melanogaster larver. Protokollet som beskrivs här gör det möjligt att observera explanthjärnor i 12-20 timmar under rätt experimentella förhållanden. Särskild hänsyn måste tas till beredningen av prover och utformningen av de önskade experimenten. Som nämnts ovan är en av de mest kritiska faktorerna som bestämmer kvaliteten på den dissekerade vävnaden larvernas hälsa. För att uppnå h?…
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning stöds av R35GM148160 (C. C.) och ett National Institutes of Health (NIH) Training Grant T32 GM007270 (RCS)
0.22 µm polyethersulfone (PES) Membrane | Genesee | 25-231 | Vacuum-driven filters |
Agar | Genesee | 20-248 | granulated agar |
Analytical Computer | Dell | NA | Intel Xeon Gold 5222 CPU with two 3.80 GHz processors running Windows 10 on a 64-bit operating system |
Bovine Growth Serum | HyClone | SH30541.02 | |
Chambered Imaging Slides | Ibidi | 80826 | |
Confocal Microscope | Nikon | NA | |
Custom-machined metal slide | NA | NA | See Cabernard and Doe 2013 (Ref. 34) for specifications |
Dissection Dishes | Fisher Scientific | 5024343 | 3-well porcelain micro spot plate |
Dissection Forceps | World Precision Instruments | Dumont #5 | |
Dissection Microscope | Leica | NA | |
Dissection Scissors | Fine Science Tools (FST) | 15003-08 | |
Embryo collection cage | Genesee | 59-100 | |
Flypad with access to CO2 to anesthetize adult flies | Genesee | 59-172 | |
Gas-permeable membrane | YSI | 98095 | Gas-permeable membrane |
Glass Cover Slides | Electron Microscopy Sciences | 72204-03 | # 1.5; 22 mm x 40 mm glass coverslips |
Imaris | Oxford Instruments | NA | Alternatives: Fiji, Volocity, Aivia |
Imaris File Converter | Oxford Instruments | NA | |
Instant Yeast | Saf-Instant | NA | |
Molasses | Genesee | 62-117 | |
Petri dish | Greiner Bio-One | 628161 | 60 mm x 15 mm Petri dish |
Petroleum Jelly | Vaseline | NA | |
Schneider's Insect Medium with L-glutamine and sodium bicarbonate liquid | Millipore Sigma | S0146 | |
SlideBook acquisition software | 3i | NA | |
Vacuum-Driven Filtration Unit with a 0.22 µµm PES membrane filter | Genesee Scientific, GenClone | 25-231 |