Summary

Levande cellavbildning av Drosophila melanogaster Tredje Instar Larval Brains

Published: June 23, 2023
doi:

Summary

Här diskuterar vi ett arbetsflöde för att förbereda, dissekera, montera och avbilda levande explanthjärnor från Drosophila melanogaster tredje instar larver för att observera den cellulära och subcellulära dynamiken under fysiologiska förhållanden.

Abstract

Drosophila neurala stamceller (neuroblaster, NBs nedan) genomgår asymmetriska uppdelningar, regenererar den självförnyande neuroblasten, samtidigt som de bildar en differentierande ganglionmodercell (GMC), som kommer att genomgå ytterligare en delning för att ge upphov till två neuroner eller glia. Studier av NB har avslöjat de molekylära mekanismerna bakom cellpolaritet, spindelorientering, självförnyelse av neurala stamceller och differentiering. Dessa asymmetriska celldelningar är lätt observerbara via levande cellavbildning, vilket gör larvala NB idealiska för att undersöka den spatiotemporala dynamiken hos asymmetrisk celldelning i levande vävnad. När de är korrekt dissekerade och avbildade i näringskompletterat medium, delar NB i explanthjärnor robust i 12-20 timmar. Tidigare beskrivna metoder är tekniskt svåra och kan vara utmanande för dem som är nya inom området. Här beskrivs ett protokoll för beredning, dissektion, montering och avbildning av levande tredje instar larvala hjärnexplantat med hjälp av fettkroppstillskott. Potentiella problem diskuteras också, och exempel ges på hur denna teknik kan användas.

Introduction

Asymmetrisk celldelning (ACD) är den process genom vilken subcellulära komponenter såsom RNA, proteiner och organeller delas ojämnt mellan dotterceller 1,2. Denna process ses ofta i stamceller, som genomgår ACD för att ge upphov till dotterceller med olika utvecklingsöden. Drosophila NB delar sig asymmetriskt för att producera en NB, som behåller sin stamhet, och en ganglionmodercell (GMC). GMC genomgår ytterligare uppdelningar för att producera differentierande neuroner eller glia3. Asymmetriskt delande NB är rikligt förekommande i de utvecklande hjärnorna hos larver från tredje instar, som lätt observeras via mikroskopi. Vid det tredje larvstadiet finns det ungefär 100 NB närvarande i varje central hjärnlob 3,4,5,6.

Asymmetrisk celldelning är en mycket dynamisk process. Live-cell imaging protokoll har använts för att mäta och kvantifiera dynamiken i cellpolaritet 7,8,9,10, spindelorientering11,12,13, dynamiken i aktomyosin cortex14,15,16,17,18, mikrotubuli och centrosombiologi 19,20,21,22,23,24,25,26,27 och membran 10,28 och kromatindynamik 29. Kvalitativa och kvantitativa beskrivningar av ACD bygger på robusta metoder och protokoll för att avbilda uppdelning av NB i intakta levande hjärnor. Följande protokoll beskriver metoder för att förbereda, dissekera och avbilda larvhjärnor från tredje instar för avbildning av levande celler in vivo med hjälp av två olika monteringsmetoder. Dessa metoder passar bäst för forskare som är intresserade av den spatiotemporala dynamiken i stamcellsdelningar, liksom delningar i andra hjärnceller, eftersom de möjliggör kort- och långsiktiga observationer av cellulära händelser. Dessutom är dessa tekniker lättillgängliga för nykomlingar på fältet. Vi demonstrerar effektiviteten och anpassningsförmågan hos detta tillvägagångssätt med larvhjärnor som uttrycker fluorescerande märkt mikrotubuli och kortikala fusionsproteiner. Vi diskuterar dessutom analysmetoder och överväganden för tillämpning i andra studier.

Protocol

OBS: Figur 1 visar de material som krävs för att utföra denna studie. 1. Överväganden och förberedelser för experimentet Förhindra att larverna är överfulla.OBS: Kvaliteten på explanterade larvhjärnor är direkt relaterad till larvernas hälsa och kvalitet före dissektion. Larver som är undernärda från överbeläggning kommer i allmänhet att ge hjärnor av lägre kvalitet30.Se till att…

Representative Results

Dissektion och avbildning av central hjärnlob NBs som uttrycker Pins::EGFP och Cherry::JupiterFör att visa upp detta protokoll, larver som uttrycker UAS-driven Cherry::Jupiter13 och endogent taggade Pins::EGFP16 (w; worGal4, UAS-cherry::jupiter/CyO; Stift::EGFP/TM6B, Tb) avbildades i 4 timmar med hjälp av det beskrivna protokollet med hjälp av multi-well imaging slides (figur 5C,D). Ytterligare data tog…

Discussion

Detta protokoll beskriver ett tillvägagångssätt för avbildning av levande explanthjärnor från Drosophila melanogaster larver. Protokollet som beskrivs här gör det möjligt att observera explanthjärnor i 12-20 timmar under rätt experimentella förhållanden. Särskild hänsyn måste tas till beredningen av prover och utformningen av de önskade experimenten. Som nämnts ovan är en av de mest kritiska faktorerna som bestämmer kvaliteten på den dissekerade vävnaden larvernas hälsa. För att uppnå h?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denna forskning stöds av R35GM148160 (C. C.) och ett National Institutes of Health (NIH) Training Grant T32 GM007270 (RCS)

Materials

0.22 µm polyethersulfone (PES) Membrane Genesee 25-231 Vacuum-driven filters
Agar Genesee 20-248 granulated agar
Analytical Computer Dell NA Intel Xeon Gold 5222 CPU with two 3.80 GHz processors running Windows 10 on a 64-bit operating system
Bovine Growth Serum HyClone SH30541.02
Chambered Imaging Slides Ibidi 80826
Confocal Microscope Nikon NA
Custom-machined metal slide NA NA See Cabernard and Doe 2013 (Ref. 34) for specifications
Dissection Dishes Fisher Scientific 5024343 3-well porcelain micro spot plate
Dissection Forceps World Precision Instruments Dumont #5
Dissection Microscope Leica NA
Dissection Scissors Fine Science Tools (FST) 15003-08
Embryo collection cage Genesee 59-100
Flypad with access to CO2 to anesthetize adult flies Genesee 59-172
Gas-permeable membrane YSI 98095 Gas-permeable membrane
Glass Cover Slides Electron Microscopy Sciences 72204-03 # 1.5; 22 mm x 40 mm glass coverslips
Imaris Oxford Instruments NA Alternatives: Fiji, Volocity, Aivia
Imaris File Converter Oxford Instruments NA
Instant Yeast Saf-Instant NA
Molasses Genesee 62-117
Petri dish Greiner Bio-One 628161 60 mm x 15 mm Petri dish
Petroleum Jelly Vaseline NA
Schneider's Insect Medium with L-glutamine and sodium bicarbonate liquid Millipore Sigma S0146
SlideBook acquisition software 3i NA
Vacuum-Driven Filtration Unit with a 0.22 µµm PES membrane filter Genesee Scientific, GenClone 25-231

References

  1. Delgado, M. K., Cabernard, C. Mechanical regulation of cell size, fate, and behavior during asymmetric cell division. Current Opinion in Cell Biology. 67, 9-16 (2020).
  2. Sunchu, B., Cabernard, C. Principles and mechanisms of asymmetric cell division. Development. 147 (13), (2020).
  3. Homem, C. C. F., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: A model for stem cell biology. Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).
  4. Gallaud, E., Pham, T., Cabernard, C. Drosophila melanogaster neuroblasts: A model for asymmetric stem cell divisions. Results and Problems in Cell Differentiation. 61 (1489), 183-210 (2017).
  5. Loyer, N., Januschke, J. Where does asymmetry come from? Illustrating principles of polarity and asymmetry establishment in Drosophila neuroblasts. Current Opinion in Cell Biology. 62, 70-77 (2020).
  6. Pollington, H. Q., Seroka, A. Q., Doe, C. Q. From temporal patterning to neuronal connectivity in Drosophila type I neuroblast lineages. Seminars in Cell & Developmental Biology. 142, 4-12 (2023).
  7. Oon, C. H., Prehoda, K. Asymmetric recruitment and actin dependent cortical flows drive the neuroblast polarity cycle. eLife. 8, e45815 (2019).
  8. Ramat, A., Hannaford, M., Januschke, J. Maintenance of miranda localization in Drosophila neuroblasts involves interaction with the cognate mRNA. Current Biology. 27 (14), 2101-2111 (2017).
  9. Oon, C. H., Prehoda, K. E. Phases of cortical actomyosin dynamics coupled to the neuroblast polarity cycle. eLife. 10, e66574 (2021).
  10. LaFoya, B., Prehoda, K. E. Actin-dependent membrane polarization reveals the mechanical nature of the neuroblast polarity cycle. Cell Reports. 35 (7), 109146 (2021).
  11. Siller, K. H., Doe, C. Q. Lis1/dynactin regulates metaphase spindle orientation in Drosophila neuroblasts. Developmental Biology. 319 (1), 1-9 (2008).
  12. Siller, K. H., Cabernard, C., Doe, C. Q. The NuMA-related Mud protein binds Pins and regulates spindle orientation in Drosophila neuroblasts. Nature Cell Biology. 8 (6), 594-600 (2006).
  13. Cabernard, C., Doe, C. Q. Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila. Developmental Cell. 17 (1), 134-141 (2009).
  14. Cabernard, C., Prehoda, K. E., Doe, C. Q. A spindle-independent cleavage furrow positioning pathway. Nature. 467 (7311), 91-94 (2010).
  15. Connell, M., Cabernard, C., Ricketson, D., Doe, C. Q., Prehoda, K. E. Asymmetric cortical extension shifts cleavage furrow position in Drosophila neuroblasts. Molecular Biology of the Cell. 22 (22), 4220-4226 (2011).
  16. Tsankova, A., Pham, T. T., Garcia, D. S., Otte, F., Cabernard, C. Cell polarity regulates biased myosin activity and dynamics during asymmetric cell division via Drosophila rho kinase and protein kinase N. Developmental Cell. 42 (2), 143-155 (2017).
  17. Montembault, E., et al. Myosin efflux promotes cell elongation to coordinate chromosome segregation with cell cleavage. Nature Communications. 8 (1), 326 (2017).
  18. Roubinet, C., et al. Spatio-temporally separated cortical flows and spindle geometry establish physical asymmetry in fly neural stem cells. Nature Communications. 8 (1), 1383 (2017).
  19. Januschke, J., et al. Centrobin controls mother-daughter centriole asymmetry in Drosophila neuroblasts. Nature Cell Biology. 15 (3), 241-248 (2013).
  20. Januschke, J., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Drosophila neuroblasts retain the daughter centrosome. Nature Communications. 2 (1), 243 (2011).
  21. Rebollo, E., et al. Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing Drosophila neural stem cells. Developmental Cell. 12 (3), 467-474 (2007).
  22. Januschke, J., Gonzalez, C. The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts. The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).
  23. Rusan, N. M., Peifer, M. A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division. The Journal of Cell Biology. 177 (1), 13-20 (2007).
  24. Lerit, D. A., et al. Interphase centrosome organization by the PLP-Cnn scaffold is required for centrosome function. Journal of Cell Biology. 210 (1), 79-97 (2015).
  25. Gallaud, E., et al. Dynamic centriolar localization of Polo and Centrobin in early mitosis primes centrosome asymmetry. PLoS Biology. 18 (8), e3000762 (2020).
  26. Ramdas Nair, A., et al. The microcephaly-associated protein Wdr62/CG7337 is required to maintain centrosome asymmetry in Drosophila neuroblasts. Cell Reports. 14 (5), 1100-1113 (2016).
  27. Singh, P., Nair, A. R., Cabernard, C. The centriolar protein Bld10/Cep135 is required to establish centrosome asymmetry in Drosophila neuroblasts. Current Biology. 24 (13), 1548-1555 (2014).
  28. LaFoya, B., Prehoda, K. E. Consumption of a polarized membrane reservoir drives asymmetric membrane expansion during the unequal divisions of neural stem cells. Developmental Cell. 1534 (23), 00159 (2023).
  29. Sunchu, B., et al. Asymmetric chromatin retention and nuclear envelopes separate chromosomes in fused cells in vivo. Communications Biology. 5 (1), 953 (2022).
  30. Oliveira, A. C., Rebelo, A. R., Homem, C. C. F. Integrating animal development: How hormones and metabolism regulate developmental transitions and brain formation. Developmental Biology. 475, 256-264 (2021).
  31. Britton, J. S., Edgar, B. A. Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms. Development. 125 (11), 2149-2158 (1998).
  32. Lee, C. -. Y., et al. Drosophila Aurora-A kinase inhibits neuroblast self-renewal by regulating aPKC/Numb cortical polarity and spindle orientation. Genes & Development. 20 (24), 3464-3474 (2006).
  33. Homem, C. C. F., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. Long-term live cell imaging and automated 4D analysis of Drosophila neuroblast lineages. PLoS ONE. 8 (11), e79588 (2013).
  34. Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), 970-977 (2013).
  35. Karpova, N., Bobinnec, Y., Fouix, S., Huitorel, P., Debec, A. Jupiter, a new Drosophila protein associated with microtubules. Cell Motility and the Cytoskeleton. 63 (5), 301-312 (2006).
  36. Loyer, N., Januschke, J. The last-born daughter cell contributes to division orientation of Drosophila larval neuroblasts. Nature Communications. 9 (1), 3745 (2018).
  37. Bostock, M. P., et al. An immobilization technique for long-term time-lapse imaging of explanted Drosophila tissues. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 590094 (2020).

Play Video

Cite This Article
Segura, R. C., Cabernard, C. Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brains. J. Vis. Exp. (196), e65538, doi:10.3791/65538 (2023).

View Video