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Summary

Este estudio presenta un modelo quirúrgico porcino de isquemia miocárdica crónica por estenosis progresiva de la arteria coronaria, que resulta en deterioro de la función cardíaca sin infarto. Después de la isquemia, los animales se someten a un injerto de derivación de la arteria coronaria sin bomba con colocación epicárdica de un parche de colágeno cargado de exosomas derivados de células madre. Esta terapia adyuvante mejora la función miocárdica y la recuperación.

Abstract

La isquemia miocárdica crónica resultante de la estenosis progresiva de la arteria coronaria conduce a la hibernación del miocardio (HIB), definido como el miocardio que se adapta a la disponibilidad reducida de oxígeno mediante la reducción de la actividad metabólica, evitando así la lesión irreversible de los cardiomiocitos y el infarto. Esto es distinto del infarto de miocardio, ya que el HIB tiene el potencial de recuperación con revascularización. Los pacientes con enfermedad arterial coronaria (EAC) significativa experimentan isquemia crónica, lo que los pone en riesgo de insuficiencia cardíaca y muerte súbita. La intervención quirúrgica estándar para la EAC grave es la cirugía de revascularización coronaria (CABG), pero se ha demostrado que es una terapia imperfecta, sin embargo, no existen terapias complementarias para recuperar miocitos adaptados a la isquemia crónica. Para abordar esta brecha, se utilizó un modelo quirúrgico de HIB que utiliza porcino que es susceptible a la cirugía de revascularización coronaria e imita el escenario clínico. El modelo incluye dos cirugías. La primera operación consiste en implantar un constrictor rígido de 1,5 mm en la arteria descendente anterior izquierda (DA). A medida que el animal crece, el constrictor causa gradualmente una estenosis significativa que resulta en una reducción de la función sistólica regional. Una vez que la estenosis alcanza el 80%, el flujo y la función miocárdica se ven afectados, creando HIB. A continuación, se realiza una cirugía de revascularización coronaria sin bomba con la arteria mamaria interna izquierda (LIMA) para revascularizar la región isquémica. El animal se recupera durante un mes para permitir una mejoría miocárdica óptima antes del sacrificio. Esto permite realizar estudios fisiológicos y tisulares de diferentes grupos de tratamiento. Este modelo animal demuestra que la función cardíaca sigue deteriorada a pesar de la cirugía de revascularización coronaria, lo que sugiere la necesidad de nuevas intervenciones complementarias. En este estudio, se desarrolló un parche de colágeno incrustado con exosomas derivados de células madre mesenquimales (MSC), que se puede aplicar quirúrgicamente a la superficie epicárdica distal a la anastomosis LIMA. El material se ajusta al epicardio, es absorbible y proporciona el andamio para la liberación sostenida de factores de señalización. Esta terapia regenerativa puede estimular la recuperación miocárdica que no responde solo a la revascularización. Este modelo se traslada al ámbito clínico al proporcionar medios de exploración fisiológica y mecanicista con respecto a la recuperación en HIB.

Introduction

A nivel mundial, la enfermedad coronaria grave afecta a más de cien millones de pacientes y, aunque la tasa de mortalidad ha disminuido, sigue siendo una de las principales causas de muerte ^1,2. La EAC tiene un amplio espectro clínico desde el infarto de miocardio (IM) hasta la isquemia con viabilidad preservada. La mayor parte de la investigación preclínica se centra en el infarto de miocardio, caracterizado por la presencia de tejido infartado, como es posible estudiar en modelos animales pequeños y grandes. Sin embargo, ese modelo no aborda a los pacientes con viabilidad preservada y susceptibles de revascularización. La mayoría de los pacientes sometidos a cirugía de revascularización coronaria tienen un suministro sanguíneo disminuido y una función limitada, al tiempo que mantienen la variabilidad en la reserva contráctil y la viabilidad³. Sin tratamiento, estos pacientes pueden progresar a insuficiencia cardíaca avanzada y muerte súbita, especialmente durante el aumento de la carga de trabajo⁴. Entre estos pacientes, el injerto de revascularización coronaria (CABG) es una terapia eficaz, pero puede no resultar en una recuperación funcional completa⁵. Es importante destacar que la disfunción diastólica, que es un marcador de peores resultados clínicos, no se recupera después de la revascularización, lo que sugiere la necesidad de nuevas terapias adyuvantes durante la cirugía de revascularización coronaria ^6,7. En la actualidad, no hay intervenciones adyuvantes clínicamente disponibles que se utilicen con la cirugía de revascularización coronaria para restaurar la capacidad funcional completa de los cardiomiocitos. Se trata de una laguna terapéutica importante, ya que muchos pacientes evolucionan a insuficiencia cardiaca avanzada a pesar de una adecuada revascularización⁸.

Se creó un innovador modelo porcino de isquemia miocárdica crónica susceptible de cirugía de revascularización coronaria, para imitar la experiencia clínica de la EAC⁹. Los cerdos proporcionan un buen modelo de enfermedad cardíaca sobre otros animales grandes, ya que no tienen colaterales puente epicárdicos, por lo que la estenosis de la DA por sí sola da lugar a una isquemia regional¹⁰. En este estudio, se utilizaron cerdos hembras Yorkshire-Landrace de 16 semanas de edad. En este modelo, la DA se revascularizó con cirugía de revascularización coronaria sin bomba utilizando el injerto de arteria mamaria interna izquierda (LIMA) (Tabla suplementaria 1). La intervención coronaria percutánea (ICP) no es posible para abrir la estenosis ya que el constrictor es un dispositivo rígido. La resonancia magnética cardíaca (RM) se utiliza para evaluar la función global y regional, la anatomía coronaria y la viabilidad de los tejidos. El análisis de la resonancia magnética cardíaca mostró que la función diastólica, caracterizada por la tasa de llenado máximo (PFR), permanece alterada a pesar de la cirugía de revascularización coronaria⁶. Es probable que el mecanismo de la disfunción diastólica se relacione con la alteración de la bioenergética mitocondrial y la formación de colágeno en la HIB que persisten después de la cirugía de revascularización coronaria¹¹.

Las células madre mesenquimales (MSC) proporcionan señalización terapéutica a través de exosomas para mejorar la recuperación miocárdica cuando se aplican durante la cirugía de revascularización coronaria. En este modelo porcino y en estudios paralelos in vitro , se demostró que la colocación de un parche epicárdico de MSC vicryl durante la cirugía de revascularización coronaria recupera la función contráctil con un aumento de las proteínas mitocondriales clave, a saber, PGC-1α¹², un importante regulador del metabolismo energético mitocondrial¹³. El modelo in vitro nos permitió investigar el mecanismo de señalización de las MSC sobre el deterioro de la función mitocondrial. Los exosomas son microvesículas estables secretadas (50-150 nm) que contienen proteínas o ácidos nucleicos, incluido el microARN (miARN)¹⁴. Datos recientes in vitro sugieren que los exosomas derivados de MSC son un importante mecanismo de señalización necesario para la recuperación de la respiración mitocondrial.

Los exosomas derivados de células madre son terapias complementarias prometedoras, ya que son fácilmente accesibles, pueden producirse comercialmente y carecen de conflictos éticos. Teniendo en cuenta la traslación clínica, se creó un parche de colágeno incrustado con exosomas derivados de MSC que se puede suturar quirúrgicamente a la región de hibernación del miocardio. Se demostró que hay una entrega sostenida de exosomas utilizando este parche y proporciona una terapia regenerativa libre de células con un mecanismo de señalización paracrina que se dirige a la recuperación mitocondrial y mejora la biogénesis mitocondrial¹⁵. Este procedimiento proporciona el modelo preclínico para estudiar el impacto de las terapias derivadas de MSC para mejorar la función cardíaca mediante la mejora de la función mitocondrial y la reducción de la inflamación en el momento de la revascularización y revertir las adaptaciones de los miocitos a la isquemia crónica.

En este estudio, se muestra un método quirúrgico de cirugía de revascularización coronaria sin bomba que utiliza anastomosis de LIMA a DA para derivar el área de estenosis de la DA proximal, imitando el tratamiento estándar para pacientes con EAC. Como terapia adyuvante con cirugía de revascularización coronaria, se demostró la aplicación quirúrgica de un parche de colágeno incluido en exosomas derivado de MSC en la región isquémica del miocardio. Este modelo quirúrgico se puede utilizar para estudiar las respuestas fisiológicas al efecto paracrino observado con el uso de un parche de exosomas, así como los mecanismos moleculares de recuperación.

Protocol

Los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales (IACUC, por sus siglas en inglés) del Centro Médico VA de Minneapolis y la Universidad de Minnesota han aprobado todos los estudios con animales. Se siguieron las directrices actuales de los Institutos Nacionales de Salud (NIH, por sus siglas en inglés) para el uso y cuidado de animales de laboratorio. 1. Aislamiento de células madre mesenquimales y preparación y caracterización de exosomas Aislamiento d…

Representative Results

Tras la revascularización, se realiza una angiografía coronaria para evaluar la estenosis de la DA (mayor del 80%) y la permeabilidad del injerto LIMA-DA (Figura 1). Cuatro semanas después de la cirugía de revascularización y la colocación del parche de colágeno cargado de exosomas, se realiza una resonancia magnética cardíaca para evaluar la función sistólica y diastólica del corazón en reposo y bajo estrés utilizando una infusión de dobutamina en dosis bajas a 5 μg/kg/min. …

Discussion

Este estudio presenta el primer modelo porcino de miocardio crónicamente isquémico, en el que se demostró que el tratamiento con un parche de colágeno cargado de exosomas derivado de MSC durante la revascularización quirúrgica recupera la función diastólica y sistólica tras la estimulación inotrópica, potencialmente al dirigirse a la recuperación mitocondrial. Previamente, se demostró que en un modelo animal grande de HIB la función diastólica y sistólica, medida por resonancia magnética cardíaca, perma…

Materials

5 Ethibond	Ethicon	MG46G	Suture
# 40 clipper blade	Oster	078919-016-701	Remove hair from surgery sites
0 Vicryl	Ethicon	J208H	Suture
1 mL Syringe	Medtronic/Covidien	1188100777	Administer injectable agents
1" medical tape	Medline	MMM15271Z	Secure wound dressing and IV catheters
1000mL 0.9% Sodium chloride	Baxter	2B1324X	IV replacement fluid
12 mL Syringe	Medtronic/Covidien	8881512878	Administer injectable agents
18 ga needles	BD	305185	Administration of injectable agents
20 ga needles	BD	305175	Administration of injectable agents
20 mL Syringe	Medtronic/Covidien	8881520657	Administer injectable agents
2-0 Vicryl	Ethicon	J317H	Suture
250 mL 0.9% saline	Baxter	UE1322D	Replacement IV Fluid
3 mL Syinge	Medtronic/Covidien	1180300555	Administer injectable agents
3-0 Vicryl	Ethicon	VCP824G	Suture
36” Pressure monitoring tubing	Smith’s Medical	MX563	Connect art. Line  to transducer
4.0 mm ID endotracheal tube	Medline	DYND43040	Establish airway for Hibernation
4-0 Tevdek II Strands	Deknatel	7-922	Suture to secure constrictor around LAD
48” Pressure monitoring tubing	Smith’s Medical	MX564	Connect art. Line  to transducer
500mL 0.9% Sodium chloride	Baxter	2B1323Q	Drug delivery, Provide mist for Blower Mister
6  mL Syringe	Medtronic/Covidien	1180600777	Administer injectable agents
6.0 mm ID endotracheal tube	Mallinckrodt	86049	Establish airway for Revasc,MRI and Termination
6.5 mm ID endotracheal tube	Medline	DYND43065	Establish airway for Revasc,MRI and Termination
6” pressure tubing line	Smith’s Medical	MX560	Collect bone marrow
60 mL Syringe	Medtronic/Covidien	8881560125	Administer injectable agents
7.0 mm ID endotracheal tube	Medline	DYND43070	Establish airway for Revasc,MRI and Termination
7-0 Prolene	Ethicon	M8702	Suture
Advanced DMEM (1X)	ThermoFisher Scientific	12491023
Alcohol Prep pads	MedSource	MS-17402	Skin disinfectant
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit	Millipore Sigma	UFC910024
Anesthesia Machine	Drager	Fabious Trio	maintains general anesthesia
Anesthesia Machine + ventilator	DRE Drager- Fabius Tiro	DRE0603FT	Deliver Oxygen and inhalant to patient
Anesthesia Monitor	Phillips  Intellivue	MP70	Multiparameter for patient safety
Arterial Line Kit	Arrow	ASK-04510-HF	Femoral catheter for blood pressure monitoring
Artificial Tears	Rugby	0536-1086-91	Lubricate eyes to prevent corneal drying
Bair Hugger	3M	Model 505	Patient Warming system
Basic pack	Medline	DYNJP1000	Sterile drapes and table cover
Blood Collection Tubes- green top	Fisher Scientific	02-689-7	Collect microsphere blood samples
Blower Mister Kit	Medtronic/Covidien	22120	Clears surgical field for vessel anastomosis
BODIPY TR Ceramide	ThermoFisher Scientific	D7540
Bone marrow needle- 25mm 15 ga IO needle	Vidacare	9001-VC-005	Collect bone marrow
Bone Wax	Medline	ETHW31G	Hemostasis of cut bone
Bovie Cautery hand piece	Covidien	E2516	Hemostasis
Bupivicaine	Pfizer	00409-1161-01	Local Anesthetic
Buprenorphine 0.3 mg/mL	Sigma Aldrich	B9275	Pre operative Analgesic for survivial procedures
Cell Scrapers	Corning	353085
Cephazolin 1 gr	Pfizer	00409-0805-01	Antibiotic
Chest Tube	Covidien	8888561043	Evacuates air from chest cavity
Cloroprep	Becton Dickenson	260815	Surgical skin prep
Corning bottle-top vacuum Filter System (500mL)	Millipore Sigma	430758
CPT tube	BD	362753	MSC isolation from bone marrow
Delrin Constrictor	U of MN	Custom made	Creates stenosis of LAD
Dermabond	Ethicon	DNX12	Skin adhesive
DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium, HEPES	ThermoFisher Scientific	12430062
Dobutamine 12.5 mg/mL	Pfizer	00409-2344-01	Increases blood pressure and heart rate during the second microsphere blood collection
ECG Pads	DRE	1496	Monitor heart rhythm
Exosome-Depleted FBS	ThermoFisher Scientific	A2720801
Falcon Disposable Polystyrene Serological Pipets, Sterile, 10mL	Fisher Scientific	13-675-20
Femoral and carotid introducer	Cordis- J&J	504606P	femoral and carotis cannulas
Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated, Gibco FBS	ThermoFisher Scientific	16140089
Flo-thru 1.0	Baxter	FT-12100	used to anastomos LIMA to L
Flo-thru 1.25	Baxter	FT-12125	FT-12125
Flo-thru 1.5	Baxter	FT-12150	FT-12150
Flo-thru 2.0	Baxter	FT-12200	FT-12200
GlutaMAX Supplement	ThermoFisher Scientific	35050061
Hair Clipper	Oster	078566-011-002	Remove hair from surgery sites
Helistat collagen sponge	McKesson	570973 1690ZZ	Sponge for embedding exosomes
Heparin	Pfizer	0409-2720-03	anticoaggulant
Histology Jars	Fisher Scientific	316-154	Formalin for tissue samples
HyClone Characterized Fetal Bovine Serum (FBS)	Cytiva	SH30071.03
Hypafix	BSN Medical	4210	Secure wound dressing and IV catheters
Isoflurane	Sigma Aldrich	CDS019936	General Anesthestic- Inhalant
IV Tubing for Blower Mister	Carefusion	42493E	Adapts to IV Fluids for Blower/Mister
Jelco 18 ga IV catheter	Smiths medical	4054	IV access in Revasc, MRI and Term
Lidocaine 2%	Pfizer	00409-4277-01	Local Anesthetic/ antiarrthymic
Ligaclips	Ethicon	MSC20	Surgical Staples for LIMA takedown
Long blade for laryngoscope	DRE	12521	Allows for visualization of trachea for intubation
Meloxicam 5 mg/mL	Boehringer Ingelheim	141-219	Post operative Analgesic
Microsphere pump			Collect blood samples from femoral introducer
Monopolar Cautery	Covidien	Valleylab™ FT10	Hemostasis
Nanosight NS 300	Malvern Panalytical	MAN0541-03-EN
NTA 3.1.54 software	Malvern Panalytical	MAN0520-01-EN-00
OPVAC Synergy II	Terumo Cardiovascular System	401-230	Heart positioner and Stabilizer
Oxygen Tank E cylinder	various	various	Used for Blower Mister if anesthesia machine doesn't have auxiliary flow meter
PBS, pH 7.2	ThermoFisher Scientific	20012050
Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture	ThermoFisher Scientific	15640055
Pigtail 145 catheter 6 French	Boston Scientific	08641-41	Measure LV pressures
Pressure Transducer	various	Must adapt to anesthesia monitor	Monitor direct arterial pressures
Propofol	Diprivan	269-29	Induction agent
Roncuronium	Mylan	67457-228-05	Neuromuscular blocking agent
SR Buprenorphine 10 mg/mL	Abbott Labs	NADA 141-434	Post operative Analgesic
Sterile Saline 20 mL	Fisher Scientific	20T700220	Flush for IV catheters
Sternal Saw/ Necropsy Saw	Thermo Fisher	812822	Used to open chest cavity
Stop Cocks	Smith Medical	MX5311L	2 to connect to pig tail
Succinylcholine 20 mg/mL	Pfizer	00409-6629-02	Neuromuscular blocking agent
Suction  tubing	Medline	DYND50223
Suction Container	Medline	DYNDCL03000
Surgery pack with chest retractor	various	See pack list	Femoral cut down and median sternotomy
Surgical Instruments	various	See pack list	Femoral and carotid cutdowns and sternotomy
Surgical Spring Clip	Applied Medical	A1801	Clamp end of LIMA after takedown
Syringe pump	Harvard		Delivers IV Dobutamine infusion
SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain – 5 mM Solution in DMSO	Millipore Sigma	S32703
Telazol 100 mg/mL	Fort Dodge	01L60030	Pre operative Sedative
Telpha pad	Covidien	2132	Sterile wound dressing
Timer			Time collection of blood samples
Total Exosome Isolation Reagent (from cell culture media)	ThermoFisher Scientific	4478359
TPP Tissue Culture Flask, T75, Filter Cap w/ 0.22uM PTFE	ThermoFisher Scientific	TP90076
Triple Antibiotic Ointment	Johnson & Johnson	23734	Topical over wound
Vicryl mesh	Ethicon	VKML	Patch for epicardial cell application
Vortex			Mix microspheres
Xylazine 100 mg/mL	Vedco	468RX	Pre operative Sedative/ analgesic