מחקר זה מתאר שיטה לבידוד וטיהור שלפוחיות חוץ-תאיות חיידקיות (BEVs) המועשרות מצואת אדם באמצעות צנטריפוגת שיפוע צפיפות (DGC), מזהה את המאפיינים הפיזיים של BEV ממורפולוגיה, גודל חלקיקים וריכוז, ודן ביישומים האפשריים של גישת DGC במחקר קליני ומדעי.
שלפוחיות חוץ-תאיות חיידקיות (BEVs) הן ננו-שלפוחיות שמקורן בחיידקים הממלאים תפקיד פעיל בתקשורת חיידקים-חיידקים וחיידקים-מארחים, ומעבירים מולקולות ביו-אקטיביות כגון חלבונים, שומנים וחומצות גרעין העוברות בתורשה מחיידקי האם. ל-BEV שמקורו במיקרוביוטה של המעי יש השפעות בתוך מערכת העיכול והוא יכול להגיע לאיברים מרוחקים, וכתוצאה מכך יש לו השלכות משמעותיות על הפיזיולוגיה והפתולוגיה. מחקרים תיאורטיים שחוקרים את הסוגים, הכמויות והתפקידים של כ”ד שמקורם בצואה אנושית חיוניים להבנת ההפרשה והתפקוד של כ”ד מהמיקרוביוטה של המעי. חקירות אלה מחייבות גם שיפור באסטרטגיה הנוכחית לבידוד וטיהור כלי רכב חשמליים.
מחקר זה ייעל את תהליך הבידוד והטיהור של כלי רכב חשמליים על ידי הקמת שני מצבי צנטריפוגה הדרגתית בצפיפות (DGC): מלמעלה למטה ומלמטה למעלה. ההתפלגות המועשרת של כלי רכב חשמליים נקבעה בשברים 6 עד 8 (F6-F8). יעילות הגישה הוערכה בהתבסס על מורפולוגיה של חלקיקים, גודל, ריכוז ותכולת חלבונים. שיעורי התאוששות החלקיקים והחלבונים חושבו, ונוכחותם של סמנים ספציפיים נותחה כדי להשוות את ההתאוששות והטוהר של שני מצבי DGC. התוצאות הצביעו על כך שמצב הצנטריפוגה מלמעלה למטה היה בעל רמות זיהום נמוכות יותר והשיג שיעור התאוששות וטוהר דומים לזה של מצב מלמטה למעלה. זמן צנטריפוגה של 7 שעות הספיק כדי להשיג ריכוז BEV צואתי של 108/מ”ג.
מלבד צואה, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על סוגים אחרים נוזלי גוף עם שינוי נכון על פי ההבדלים ברכיבים צמיגות. לסיכום, פרוטוקול מפורט ואמין זה יקל על בידוד וטיהור סטנדרטיים של כ”ד ובכך יניח בסיס לניתוח מולטי-אומיקס וניסויים פונקציונליים הבאים.
המעי מוכר באופן נרחב כאיבר המאחסן את קהילות החיידקים הנפוצות ביותר בגוף האדם, כאשר מעל 90% מהחיידקים מעורבים בהתיישבות ובהכפלה 1,2. עדויות נרחבות הוכיחו כי מיקרוביוטת המעיים מווסתת את המיקרו-סביבה של המעי ובו זמנית מתקשרת עם תפקוד לקוי באיברים מרוחקים, בעיקר באמצעות מחסום מעיים לקוי 3,4. עדויות מצטברות מצביעות על מתאם בין חוסר איזון של מיקרוביוטת המעי לבין התקדמות מחלות מעי דלקתיות (IBD)5,6, כמו גם הפרעות קוגניטיביות דרך ציר מעי-מוח 5,6,7,8. שלפוחיות חוץ-תאיות חיידקיות (BEVs) המיוצרות על ידי חיידקים ממלאות תפקידים משמעותיים בתהליכים פתולוגיים אלה.
BEV הם חלקיקים ננומטריים העוטפים נגזרות חיידקיות, בקטרים הנעים בין 20 ל-400 ננומטר. הם הוכחו כמסייעים לאינטראקציות בין חיידקים לבין האורגניזמים המארחים שלהם 9,10. למרות היותם בלתי נראים, חלקיקים אלה זכו לתשומת לב הולכת וגוברת מצד חוקרים בשל היישומים הרחבים הפוטנציאליים שלהם כסמנים ביולוגיים אבחנתיים, מטרות טיפוליות וכלי משלוח תרופות11. צואת אדם, המשמשת לעתים קרובות כדגימות ביולוגיות לחקר BEVs, שמקורה בעיקר בחיידקי מעיים, מכילה תערובת מורכבת של מים, חיידקים, שומנים, חלבונים, שאריות מזון לא מעוכלות ותאי אפיתל מתקלפים, בין היתר. הרכב הצואה המורכב מציב אתגרים לבידוד ולטוהר של כלי רכב חשמליים, ובכך מעכב ניתוח מקיף, אובייקטיבי ומציאותי של כלי רכב חשמליים. לפיכך, אסטרטגיות יעילות למזעור הפרעות מרכיבים מזהמים ושיפור התפוקה של BEV התגלו כנושאים קריטיים המצדיקים תשומת לב מיידית.
אסטרטגיות בידוד קיימות מסתמכות במידה רבה על טכניקות כגון צנטריפוגה במהירות גבוהה במיוחד (UC), צנטריפוגה שיפוע צפיפות (DGC) וכרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC)12,13,14,15,16,17. נכון לעכשיו, DGC היא אחת השיטות המיושמות ביותר בתחום הפרדת BEV, הכוללת שני מצבי שיקוע צפים, “מלמעלה למטה” ו “מלמטה למעלה”, אשר נקבעים על ידי מיקום הטעינה הראשונית של המדגם. מתודולוגיות אלה מבדילות בועיות חוץ-תאיות (EVs) מרכיבים אחרים בהתבסס על פערי גודל וצפיפות, ומניבות שיעורי טוהר והתאוששות משתנים. מחקרים קודמים הצביעו על כך שאסטרטגיות של גישה אחת אינן מספיקות להפרדה מספקת של כלי רכב חשמליים מחלבונים מסיסים בדגימות נוזלי גוף, כגון ליפופרוטאין בדם18 וחלבון Tamm-Horsfall בשתן19. בנוסף, התפלגות הגודל של שלפוחיות חוץ-תאיות אאוקריוטיות (EEVs) חופפת לעתים קרובות לזו של BEVs, ולכן מחייבת שיפורים מתודולוגיים נוספים כדי לייעל את תפוקת ה-BEV. כתוצאה מכך, קידום המחקר של BEV תלוי בפיתוח מתודולוגיות הפרדה וטיהור יעילות. יש לציין כי Tulkens et al 15 השתמשו באסטרטגיה ביופיזיקלית אורתוגונלית כדי להפריד בין כלי רכב חשמליים צואתיים לבין EEVs, שבה זמן הצנטריפוגה של מצב DGC מלמטה למעלה היה עד18 שעות. לעומת זאת, מחקר זה צמצם אותו ל-7 שעות, ובכך חסך מאוד את זמן האולטרה-צנטריפוגה ההדרגתית ופישט את התהליך.
במחקר הנוכחי, בודדנו וטיהרנו כלי רכב חשמליים צואתיים באמצעות שני מצבי DGC בתנאי חיץ אופטימליים, לאחר שהעשרת כלי רכב חשמליים במגוון מהירויות צנטריפוגה דיפרנציאליות, ממהירות נמוכה למהירות גבוהה במיוחד. הערכות המבוססות על מורפולוגיה, גודל חלקיקים וריכוז הצביעו על ביצועים ראויים לשבח בשיטה משופרת זו. מחקר זה יכול לשמש בסיס למחקר עתידי, להרחיב את יישומו לתחום רחב יותר, ולהציע תובנות לגבי ההטרוגניות של כלי רכב חשמליים בגוף האדם. זה גם תורם לסטנדרטיזציה של הפרדת BEV וטכניקות ניתוח.
שלפוחיות חוץ-תאיות חיידקיות (BEVs) הן ננו-חלקיקים דו-שכבתיים ליפידים המופרשים על-ידי חיידקים, נושאים שפע של חלבונים, שומנים, חומצות גרעין ומולקולות ביו-אקטיביות אחרות, התורמות לתיווך ההשפעות התפקודיות של חיידקים20. BEV שמקורו במעיים אומת כמעורב בהתפתחות מחלות, כגון מחלות מעי דלקת?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע לחוקרים צעירים מצטיינים (82025024); פרויקט המפתח של הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82230080); תוכנית המו”פ הלאומית של סין (2021YFA1300604); הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81871735, 82272438 ו-82002245); קרן גואנגדונג למדעי הטבע לחוקרים צעירים מצטיינים (2023B1515020058); הקרן למדעי הטבע של מחוז גואנגדונג (2021A1515011639); תוכנית פיתוח המחקר הבסיסית של הקרן למדעי הטבע של פרובינציית שאנדונג בסין (ZR2020ZD11); הקרן לפוסט-דוקטורט במדע (2022M720059); תוכנית פיתוח הצעירים המצטיינים של בית החולים נאן-פאנג, האוניברסיטה הרפואית הדרומית (2022J001).
1 % (w/v) glutaraldehyde (prepared from 2.5 % stock solution in deionized water) | ACMEC | AP1126 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.3 |
1 % (w/v) methylcellulose (prepared from original powder in deionized water) | Sigma-Aldrich | M7027 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.6 |
1.5 % (w/v) uranyl acetate (prepared from original powder in deionized water) | Polysciences | 21447-25 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.5 |
1000 μL, 200 μL, 10 μL Pipette | KIRGEN | KG1313, KG1212, KG1011 | Transfer the solution |
5 % (w/v) bovine serum albumin solution (prepared from the original powder in TBST buffer) | Fdbio science | FD0030 | Used in western blotting for blocking at Step 8.5.6 |
5 × loading buffer | Fdbio science | FD006 | Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5.1 |
75 % (v/v) alcohol | LIRCON | LIRCON-500 mL | Surface disinfection |
96-well plate | Rar | A8096 | Measure the absorbance values |
Anti-Calnexin antibody | Abcam | ab92573 | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-CD63 antibody | Abcam | ab134045 | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-CD9 antibody | Abcam | ab236630 | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-Flagellin antibody | Sino Biological | 40067-MM06 | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-Integrin beta 1 antibody | Abcam | ab30394 | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-LPS antibody | Thermo Fisher | MA1-83152 | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-LTA antibody | Thermo Fisher | MA1-7402 | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-OmpA antibody | CUSABIO | CSB-PA359226ZA01EOD, https://www.cusabio.com/ | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-Syntenin antibody | Abcam | ab133267 | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-TSG101 antibody | Abcam | ab125011 | Western blotting (Primary Antibody) |
Autoclave | ZEALWAY | GR110DP | Sterilization for supplies and mediums used in the experiment |
Balance | Mettler Toledo | AL104 | Balance the tube sample-loaded with PBS |
Bicinchoninic acid assay | Fdbio science | FD2001 | Measure protein content of BEVs at Step 8.2 |
BioRender | BioRender | https://app.biorender.com | Make the schematic workflow of BEVs isolation and purification showed in Figure 1 |
Biosafety cabinet | Haier | HR1200- II B2 | Peform the procedures about feces sample handling |
Centrifuge 5810 R; Rotor F-34-6-38 | Eppendorf | 5805000092; 5804727002, adapter: 5804774000 | Preprocess for BEVs (Step 3) |
Chemiluminescence Apparatus | BIO-OI | OI600SE-MF | Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12 |
Cytation 5 | BioTek | F01 | Microplate detector for measuring the absorbance (Step 8.1) and fluorescence (Figure 6) values |
Dil-labled low density lipoprotein | ACMEC | AC12038 | Definition of distribution of interfering components |
Electrophoresis equipment | Bio-rad | 1658033 | Used in western blotting for protein separation and transfer at Step 8.5.2, 8.5.3, 8.5.5 |
Enhanced Chemiluminescence kit HRP | Fdbio science | FD8020 | Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12 |
Escherichia coli | American Type Culture Collection | ATCC8739 | Isolate BEVs as a positive control. Protocol: Dissolve 25 g of the LB powder in 1 L deionized water, and autoclave. Transfer the 800 μL of preserved Escherichia coli into the medium. Cultivate at 37 °C in the incubator shaker. Then centrifuge at 3, 000 × g for 20 min at 4 °C, 12, 000 × g for 30 min at 4 °C, filter the supernatant through 0.22 μm membrane, and perform ultra-speed centrifugation at 160, 000 × g for 70 min at 4 °C. Pellet defined as crude BEVs from Escherichia coli was suspended in 1.2 mL PBS (Step 3, 4). |
Falcon tubes 50 mL | KIRGEN | KG2811 | Preprocess for BEVs (Step 3) |
Feto Protein Staining Buffer | Absci | ab.001.50 | Coomassie brilliant blue staining at Step 8.5.4 |
Filter paper | Biosharp | BS-TFP-070B | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 (Blotting the solution) |
Formvar/Carbon supported copper grids | Sigma-Aldrich | TEM-FCF200CU50 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 |
HEPES powder | Meilunbio | MB6078 | Prepare iodixanol buffers with different concentrations for density gradient centrifugation |
HRP AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Fdbio science | FDM007 | Western blotting (Secondary Antibody) |
HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Fdbio science | FDR007 | Western blotting (Secondary Antibody) |
Incubator shaker | Qiangwen | DHZ-L | Cultivate Escherichia coli |
Kimwipes™ Delicate Task Wipes | Kimtech Science | 34155 | Wipe the inner wall of the ultracentrifuge tube at Step 4.15 |
LB broth | Hopebio | HB0128 | Cultivate Escherichia coli |
Low temperature freezer (-80 °C) | Haier | DW-86L338J | Store the samples |
Methanol | Alalddin | M116118 | Used in western blotting for activating PVDF membrane at Step 8.5.5 |
Micro tubes 1.5 mL | KIRGEN | KG2211 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
Micro tubes 2 mL | KIRGEN | KG2911 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
Micro tubes 5 mL | BBI | F610888-0001 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
Microplate reader | Thermo Fisher | Multiskan MK3 | Measure protein content of BEVs at Step 8.2 |
Millipore filter 0.22 μm | Merck millipore | SLGP033RB | Filtration sterilization; Material: polyethersulfone, PES |
NaCl | GHTECH | 1.01307.040 | Density gradient centrifugation solution |
NaOH | GHTECH | 1.01394.068 | Density gradient centrifugation solution (pH adjustment) |
Optima™ XPN-100 | Beckman Coulter | A94469 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
OptiPrep™ | Serumwerk Bernburg AG | 1893 | Density gradient centrifugation stock solution |
Orbital Shaker | Youning | CS-100 | Dissolve feces at Step 2 |
Phosphate buffered saline | Procell | PB180327 | Dissolve feces at Step 2 |
Pipettor | Eppendorf | 3120000267, 3120000259 | Transfer the solution |
Plastic pasteur pipette | ABCbio | ABC217003-4 | Remove supernatant in preprocessing at Step 3.4 |
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes | Millipore | ISEQ00010, IPVH00010 | Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5 |
Prefabricated polyacrylamide gel, 4–20% 15 Wells | ACE | F15420Gel | Used in western blotting for protein separation at Step 8.5.2, 8.5.3 |
Primary antibody diluent | Fdbio science | FD0040 | Used in western blotting at Step 8.5.8 |
Protein ladder | Fdbio science | FD0672 | Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5 |
Rapid protein blotting solution | UBIO | UW0500 | Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5 |
Rotor SW 32 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 369650 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
Syringe 20 mL, 50 mL | Jetway | ZSQ-20ML, YCXWJZSQ-50 mL | Transfer buffers amd remove supernatant in preprocessing |
TBS powder | Fdbio science | FD1021 | Used in western blotting at Step 8.5 |
Transmission electron microscope (TEM) | Hitachi | H-7650 | Morphological observation for BEVs at Step 8.3 |
Tween-20 | Fdbio science | FD0020 | Used in western blotting at Step 8.5 |
Ultracentrifuge tube | Beckman | 326823, 355642 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
Ultra-clean bench | AIRTECH | SW-CJ-2FD | Peform the procedures about liquid handling |
Water bath | Bluepard | CU600 | Used for measuring protein content of BEVs at Step 8.2.5 |
ZetaView | Particle Metrix | S/N 21-734, Software ZetaView (version 8.05.14 SP7) | Nanoparticle tracking analysis (NTA) for measuring the particle size and concentrarion of BEVs at Step 8.4 |