Denna studie beskriver en metod för att isolera och rena bakteriella extracellulära vesiklar (BEV) anrikade från mänsklig avföring via densitetsgradientcentrifugering (DGC), identifierar de fysiska egenskaperna hos BEV från morfologi, partikelstorlek och koncentration och diskuterar de potentiella tillämpningarna av DGC-metoden inom klinisk och vetenskaplig forskning.
Bakteriella extracellulära vesiklar (BEV) är nanovesiklar som härrör från bakterier som spelar en aktiv roll i bakterie-bakterier och bakterie-värdkommunikation, och överför bioaktiva molekyler som proteiner, lipider och nukleinsyror som ärvs från moderbakterierna. BEV som härrör från tarmmikrobiotan har effekter i mag-tarmkanalen och kan nå avlägsna organ, vilket resulterar i betydande konsekvenser för fysiologi och patologi. Teoretiska undersökningar som utforskar typerna, kvantiteterna och rollerna för BEV som härrör från mänsklig avföring är avgörande för att förstå utsöndringen och funktionen av BEV från tarmmikrobiotan. Dessa undersökningar kräver också en förbättring av den nuvarande strategin för isolering och rening av batterielbilar.
Denna studie optimerade isolerings- och reningsprocessen för batterielbilar genom att etablera två lägen för gradientcentrifugering (DGC): Top-down och Bottom-up. Den anrikade fördelningen av batterielbilar bestämdes i fraktionerna 6 till 8 (F6-F8). Metodens effektivitet utvärderades baserat på partikelmorfologi, storlek, koncentration och proteininnehåll. Partikel- och proteinåtervinningshastigheterna beräknades, och förekomsten av specifika markörer analyserades för att jämföra återhämtningen och renheten hos de två DGC-lägena. Resultaten indikerade att Top-down-centrifugeringsläget hade lägre föroreningsnivåer och uppnådde en återvinningsgrad och renhet som liknade den för Bottom-up-läget. En centrifugeringstid på 7 timmar var tillräcklig för att uppnå en fekal BEV-koncentration på10,8/mg.
Förutom avföring kan denna metod tillämpas på andra typer av kroppsvätskor med korrekt modifiering beroende på skillnaderna i komponenter och viskositet. Sammanfattningsvis skulle detta detaljerade och tillförlitliga protokoll underlätta standardiserad isolering och rening av batterielbilar och därmed lägga en grund för efterföljande multi-omics-analys och funktionella experiment.
Tarmen är allmänt erkänd som det organ som hyser de mest rikliga mikrobiella samhällena i människokroppen, med över 90 % av bakterierna involverade i kolonisering och förökning 1,2. Omfattande bevis har visat att tarmmikrobiotan modulerar tarmmikromiljön och samtidigt interagerar med dysfunktion i avlägsna organ, främst genom en försämrad tarmbarriär 3,4. Allt fler bevis tyder på ett samband mellan obalansen i tarmmikrobiotan och progressionen av inflammatorisk tarmsjukdom (IBD)5,6, samt kognitiva störningar genom tarm-hjärna-axeln 5,6,7,8. Bakteriella extracellulära vesiklar (BEV) som produceras av bakterier spelar en viktig roll i dessa patologiska processer.
BEV är partiklar i nanoskala som kapslar in bakteriederivat, med diametrar från 20 till 400 nm. De har visat sig underlätta interaktioner mellan bakterier och deras värdorganismer 9,10. Trots deras osynlighet har dessa partiklar fått allt större uppmärksamhet från forskare på grund av deras potentiella breda tillämpningar som diagnostiska biomarkörer, terapeutiska mål och bärare av läkemedel11. Mänsklig avföring, som ofta används som bioprover för att studera BEV, huvudsakligen från tarmbakterier, innehåller en komplex blandning av bland annat vatten, bakterier, lipider, proteiner, osmälta matrester och exfolierade epitelceller. Den intrikata fekala sammansättningen innebär utmaningar för isoleringen och renheten hos batterielbilar, vilket hindrar en heltäckande, objektiv och realistisk analys av batterielbilar. Därför har effektiva strategier för att minimera störningar från förorenande komponenter och öka utbytet av batterielbilar dykt upp som kritiska frågor som kräver omedelbar uppmärksamhet.
Befintliga isoleringsstrategier bygger till stor del på tekniker som ultrahöghastighetscentrifugering (UC), densitetsgradientcentrifugering (DGC) och storleksuteslutningskromatografi (SEC)12,13,14,15,16,17. För närvarande är DGC en av de mest använda metoderna inom BEV-separering, och omfattar två sedimentationsflytande lägen, “Top-down” och “Bottom-up”, som bestäms av provets initiala lastningsposition. Dessa metoder skiljer extracellulära vesiklar (EV) från andra komponenter baserat på skillnader i storlek och densitet, vilket ger varierande renhet och återhämtningshastigheter. Tidigare forskning har indikerat att strategier med ett enda tillvägagångssätt är otillräckliga för att på ett adekvat sätt separera EV från lösliga proteiner i kroppsvätskeprover, såsom lipoprotein i blod18 och Tamm-Horsfall-protein i urin19. Dessutom överlappar storleksfördelningen för eukaryota extracellulära vesiklar (EEV) ofta med storleksfördelningen för BEV, vilket kräver ytterligare metodologiska förbättringar för att optimera BEV-utbytet. Följaktligen är utvecklingen av effektiva separations- och reningsmetoder beroende av att studier av batterielfordon förs framåt. Noterbart är att Tulkens et al 15 använde en ortogonal biofysisk strategi för att separera fekala BEV från EEV, där centrifugeringstiden för ett Bottom-up DGC-läge var upp till18 timmar. Däremot reducerade denna studie den till 7 timmar, vilket avsevärt sparade gradient-ultracentrifugeringstiden och förenklade processen.
I den aktuella studien isolerade och renade vi fekala BEV:er med hjälp av två DGC-lägen under optimerade buffertförhållanden, efter att ha berikat BEV:er med en rad differentiella centrifugeringshastigheter, från låg till extremt hög hastighet. Utvärderingar baserade på morfologi, partikelstorlek och koncentration indikerade en berömvärd prestanda med denna förbättrade metod. Denna studie kan fungera som grund för framtida forskning, utvidga dess tillämpningar till ett bredare område och ge insikter om heterogeniteten hos BEV i människokroppen. Det bidrar också till standardiseringen av BEV-separations- och analystekniker.
Bakteriella extracellulära vesiklar (BEV) är lipid-dubbelskiktsnanopartiklar som utsöndras av bakterier, som bär på en mängd proteiner, lipider, nukleinsyror och andra bioaktiva molekyler, vilket bidrar till att förmedla bakteriernas funktionella effekter20. BEV som härrör från tarmen har verifierats vara involverade i utvecklingen av sjukdomar, såsom inflammatorisk tarmsjukdom, Crohns sjukdom och kolorektal cancer, och påverkar också den allmänna ämnesomsättningen och medierar ned…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av National Science Fund for Distinguished Young Scholars (82025024); Nyckelprojektet för Kinas nationella naturvetenskapliga stiftelse (82230080). Kinas nationella viktiga FoU-program (2021YFA1300604); Kinas nationella naturvetenskapliga stiftelse (81871735, 82272438 och 82002245); Guangdongs naturvetenskapliga fond för framstående unga forskare (2023B1515020058); Naturvetenskapliga stiftelsen i provinsen Guangdong (2021A1515011639). det stora statliga programmet för utveckling av grundforskning vid Natural Science Foundation i Shandongprovinsen i Kina (ZR2020ZD11); Stiftelsen för postdoktoral vetenskap (2022M720059). Outstanding Youths Development Scheme of Nanfang Hospital, Southern Medical University (2022J001).
1 % (w/v) glutaraldehyde (prepared from 2.5 % stock solution in deionized water) | ACMEC | AP1126 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.3 |
1 % (w/v) methylcellulose (prepared from original powder in deionized water) | Sigma-Aldrich | M7027 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.6 |
1.5 % (w/v) uranyl acetate (prepared from original powder in deionized water) | Polysciences | 21447-25 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.5 |
1000 μL, 200 μL, 10 μL Pipette | KIRGEN | KG1313, KG1212, KG1011 | Transfer the solution |
5 % (w/v) bovine serum albumin solution (prepared from the original powder in TBST buffer) | Fdbio science | FD0030 | Used in western blotting for blocking at Step 8.5.6 |
5 × loading buffer | Fdbio science | FD006 | Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5.1 |
75 % (v/v) alcohol | LIRCON | LIRCON-500 mL | Surface disinfection |
96-well plate | Rar | A8096 | Measure the absorbance values |
Anti-Calnexin antibody | Abcam | ab92573 | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-CD63 antibody | Abcam | ab134045 | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-CD9 antibody | Abcam | ab236630 | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-Flagellin antibody | Sino Biological | 40067-MM06 | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-Integrin beta 1 antibody | Abcam | ab30394 | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-LPS antibody | Thermo Fisher | MA1-83152 | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-LTA antibody | Thermo Fisher | MA1-7402 | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-OmpA antibody | CUSABIO | CSB-PA359226ZA01EOD, https://www.cusabio.com/ | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-Syntenin antibody | Abcam | ab133267 | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-TSG101 antibody | Abcam | ab125011 | Western blotting (Primary Antibody) |
Autoclave | ZEALWAY | GR110DP | Sterilization for supplies and mediums used in the experiment |
Balance | Mettler Toledo | AL104 | Balance the tube sample-loaded with PBS |
Bicinchoninic acid assay | Fdbio science | FD2001 | Measure protein content of BEVs at Step 8.2 |
BioRender | BioRender | https://app.biorender.com | Make the schematic workflow of BEVs isolation and purification showed in Figure 1 |
Biosafety cabinet | Haier | HR1200- II B2 | Peform the procedures about feces sample handling |
Centrifuge 5810 R; Rotor F-34-6-38 | Eppendorf | 5805000092; 5804727002, adapter: 5804774000 | Preprocess for BEVs (Step 3) |
Chemiluminescence Apparatus | BIO-OI | OI600SE-MF | Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12 |
Cytation 5 | BioTek | F01 | Microplate detector for measuring the absorbance (Step 8.1) and fluorescence (Figure 6) values |
Dil-labled low density lipoprotein | ACMEC | AC12038 | Definition of distribution of interfering components |
Electrophoresis equipment | Bio-rad | 1658033 | Used in western blotting for protein separation and transfer at Step 8.5.2, 8.5.3, 8.5.5 |
Enhanced Chemiluminescence kit HRP | Fdbio science | FD8020 | Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12 |
Escherichia coli | American Type Culture Collection | ATCC8739 | Isolate BEVs as a positive control. Protocol: Dissolve 25 g of the LB powder in 1 L deionized water, and autoclave. Transfer the 800 μL of preserved Escherichia coli into the medium. Cultivate at 37 °C in the incubator shaker. Then centrifuge at 3, 000 × g for 20 min at 4 °C, 12, 000 × g for 30 min at 4 °C, filter the supernatant through 0.22 μm membrane, and perform ultra-speed centrifugation at 160, 000 × g for 70 min at 4 °C. Pellet defined as crude BEVs from Escherichia coli was suspended in 1.2 mL PBS (Step 3, 4). |
Falcon tubes 50 mL | KIRGEN | KG2811 | Preprocess for BEVs (Step 3) |
Feto Protein Staining Buffer | Absci | ab.001.50 | Coomassie brilliant blue staining at Step 8.5.4 |
Filter paper | Biosharp | BS-TFP-070B | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 (Blotting the solution) |
Formvar/Carbon supported copper grids | Sigma-Aldrich | TEM-FCF200CU50 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 |
HEPES powder | Meilunbio | MB6078 | Prepare iodixanol buffers with different concentrations for density gradient centrifugation |
HRP AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Fdbio science | FDM007 | Western blotting (Secondary Antibody) |
HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Fdbio science | FDR007 | Western blotting (Secondary Antibody) |
Incubator shaker | Qiangwen | DHZ-L | Cultivate Escherichia coli |
Kimwipes™ Delicate Task Wipes | Kimtech Science | 34155 | Wipe the inner wall of the ultracentrifuge tube at Step 4.15 |
LB broth | Hopebio | HB0128 | Cultivate Escherichia coli |
Low temperature freezer (-80 °C) | Haier | DW-86L338J | Store the samples |
Methanol | Alalddin | M116118 | Used in western blotting for activating PVDF membrane at Step 8.5.5 |
Micro tubes 1.5 mL | KIRGEN | KG2211 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
Micro tubes 2 mL | KIRGEN | KG2911 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
Micro tubes 5 mL | BBI | F610888-0001 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
Microplate reader | Thermo Fisher | Multiskan MK3 | Measure protein content of BEVs at Step 8.2 |
Millipore filter 0.22 μm | Merck millipore | SLGP033RB | Filtration sterilization; Material: polyethersulfone, PES |
NaCl | GHTECH | 1.01307.040 | Density gradient centrifugation solution |
NaOH | GHTECH | 1.01394.068 | Density gradient centrifugation solution (pH adjustment) |
Optima™ XPN-100 | Beckman Coulter | A94469 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
OptiPrep™ | Serumwerk Bernburg AG | 1893 | Density gradient centrifugation stock solution |
Orbital Shaker | Youning | CS-100 | Dissolve feces at Step 2 |
Phosphate buffered saline | Procell | PB180327 | Dissolve feces at Step 2 |
Pipettor | Eppendorf | 3120000267, 3120000259 | Transfer the solution |
Plastic pasteur pipette | ABCbio | ABC217003-4 | Remove supernatant in preprocessing at Step 3.4 |
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes | Millipore | ISEQ00010, IPVH00010 | Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5 |
Prefabricated polyacrylamide gel, 4–20% 15 Wells | ACE | F15420Gel | Used in western blotting for protein separation at Step 8.5.2, 8.5.3 |
Primary antibody diluent | Fdbio science | FD0040 | Used in western blotting at Step 8.5.8 |
Protein ladder | Fdbio science | FD0672 | Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5 |
Rapid protein blotting solution | UBIO | UW0500 | Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5 |
Rotor SW 32 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 369650 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
Syringe 20 mL, 50 mL | Jetway | ZSQ-20ML, YCXWJZSQ-50 mL | Transfer buffers amd remove supernatant in preprocessing |
TBS powder | Fdbio science | FD1021 | Used in western blotting at Step 8.5 |
Transmission electron microscope (TEM) | Hitachi | H-7650 | Morphological observation for BEVs at Step 8.3 |
Tween-20 | Fdbio science | FD0020 | Used in western blotting at Step 8.5 |
Ultracentrifuge tube | Beckman | 326823, 355642 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
Ultra-clean bench | AIRTECH | SW-CJ-2FD | Peform the procedures about liquid handling |
Water bath | Bluepard | CU600 | Used for measuring protein content of BEVs at Step 8.2.5 |
ZetaView | Particle Metrix | S/N 21-734, Software ZetaView (version 8.05.14 SP7) | Nanoparticle tracking analysis (NTA) for measuring the particle size and concentrarion of BEVs at Step 8.4 |