Summary

Isolering och rening av bakteriella extracellulära vesiklar från mänsklig avföring med hjälp av densitetsgradientcentrifugering

Published: September 01, 2023
doi:

Summary

Denna studie beskriver en metod för att isolera och rena bakteriella extracellulära vesiklar (BEV) anrikade från mänsklig avföring via densitetsgradientcentrifugering (DGC), identifierar de fysiska egenskaperna hos BEV från morfologi, partikelstorlek och koncentration och diskuterar de potentiella tillämpningarna av DGC-metoden inom klinisk och vetenskaplig forskning.

Abstract

Bakteriella extracellulära vesiklar (BEV) är nanovesiklar som härrör från bakterier som spelar en aktiv roll i bakterie-bakterier och bakterie-värdkommunikation, och överför bioaktiva molekyler som proteiner, lipider och nukleinsyror som ärvs från moderbakterierna. BEV som härrör från tarmmikrobiotan har effekter i mag-tarmkanalen och kan nå avlägsna organ, vilket resulterar i betydande konsekvenser för fysiologi och patologi. Teoretiska undersökningar som utforskar typerna, kvantiteterna och rollerna för BEV som härrör från mänsklig avföring är avgörande för att förstå utsöndringen och funktionen av BEV från tarmmikrobiotan. Dessa undersökningar kräver också en förbättring av den nuvarande strategin för isolering och rening av batterielbilar.

Denna studie optimerade isolerings- och reningsprocessen för batterielbilar genom att etablera två lägen för gradientcentrifugering (DGC): Top-down och Bottom-up. Den anrikade fördelningen av batterielbilar bestämdes i fraktionerna 6 till 8 (F6-F8). Metodens effektivitet utvärderades baserat på partikelmorfologi, storlek, koncentration och proteininnehåll. Partikel- och proteinåtervinningshastigheterna beräknades, och förekomsten av specifika markörer analyserades för att jämföra återhämtningen och renheten hos de två DGC-lägena. Resultaten indikerade att Top-down-centrifugeringsläget hade lägre föroreningsnivåer och uppnådde en återvinningsgrad och renhet som liknade den för Bottom-up-läget. En centrifugeringstid på 7 timmar var tillräcklig för att uppnå en fekal BEV-koncentration på10,8/mg.

Förutom avföring kan denna metod tillämpas på andra typer av kroppsvätskor med korrekt modifiering beroende på skillnaderna i komponenter och viskositet. Sammanfattningsvis skulle detta detaljerade och tillförlitliga protokoll underlätta standardiserad isolering och rening av batterielbilar och därmed lägga en grund för efterföljande multi-omics-analys och funktionella experiment.

Introduction

Tarmen är allmänt erkänd som det organ som hyser de mest rikliga mikrobiella samhällena i människokroppen, med över 90 % av bakterierna involverade i kolonisering och förökning 1,2. Omfattande bevis har visat att tarmmikrobiotan modulerar tarmmikromiljön och samtidigt interagerar med dysfunktion i avlägsna organ, främst genom en försämrad tarmbarriär 3,4. Allt fler bevis tyder på ett samband mellan obalansen i tarmmikrobiotan och progressionen av inflammatorisk tarmsjukdom (IBD)5,6, samt kognitiva störningar genom tarm-hjärna-axeln 5,6,7,8. Bakteriella extracellulära vesiklar (BEV) som produceras av bakterier spelar en viktig roll i dessa patologiska processer.

BEV är partiklar i nanoskala som kapslar in bakteriederivat, med diametrar från 20 till 400 nm. De har visat sig underlätta interaktioner mellan bakterier och deras värdorganismer 9,10. Trots deras osynlighet har dessa partiklar fått allt större uppmärksamhet från forskare på grund av deras potentiella breda tillämpningar som diagnostiska biomarkörer, terapeutiska mål och bärare av läkemedel11. Mänsklig avföring, som ofta används som bioprover för att studera BEV, huvudsakligen från tarmbakterier, innehåller en komplex blandning av bland annat vatten, bakterier, lipider, proteiner, osmälta matrester och exfolierade epitelceller. Den intrikata fekala sammansättningen innebär utmaningar för isoleringen och renheten hos batterielbilar, vilket hindrar en heltäckande, objektiv och realistisk analys av batterielbilar. Därför har effektiva strategier för att minimera störningar från förorenande komponenter och öka utbytet av batterielbilar dykt upp som kritiska frågor som kräver omedelbar uppmärksamhet.

Befintliga isoleringsstrategier bygger till stor del på tekniker som ultrahöghastighetscentrifugering (UC), densitetsgradientcentrifugering (DGC) och storleksuteslutningskromatografi (SEC)12,13,14,15,16,17. För närvarande är DGC en av de mest använda metoderna inom BEV-separering, och omfattar två sedimentationsflytande lägen, “Top-down” och “Bottom-up”, som bestäms av provets initiala lastningsposition. Dessa metoder skiljer extracellulära vesiklar (EV) från andra komponenter baserat på skillnader i storlek och densitet, vilket ger varierande renhet och återhämtningshastigheter. Tidigare forskning har indikerat att strategier med ett enda tillvägagångssätt är otillräckliga för att på ett adekvat sätt separera EV från lösliga proteiner i kroppsvätskeprover, såsom lipoprotein i blod18 och Tamm-Horsfall-protein i urin19. Dessutom överlappar storleksfördelningen för eukaryota extracellulära vesiklar (EEV) ofta med storleksfördelningen för BEV, vilket kräver ytterligare metodologiska förbättringar för att optimera BEV-utbytet. Följaktligen är utvecklingen av effektiva separations- och reningsmetoder beroende av att studier av batterielfordon förs framåt. Noterbart är att Tulkens et al 15 använde en ortogonal biofysisk strategi för att separera fekala BEV från EEV, där centrifugeringstiden för ett Bottom-up DGC-läge var upp till18 timmar. Däremot reducerade denna studie den till 7 timmar, vilket avsevärt sparade gradient-ultracentrifugeringstiden och förenklade processen.

I den aktuella studien isolerade och renade vi fekala BEV:er med hjälp av två DGC-lägen under optimerade buffertförhållanden, efter att ha berikat BEV:er med en rad differentiella centrifugeringshastigheter, från låg till extremt hög hastighet. Utvärderingar baserade på morfologi, partikelstorlek och koncentration indikerade en berömvärd prestanda med denna förbättrade metod. Denna studie kan fungera som grund för framtida forskning, utvidga dess tillämpningar till ett bredare område och ge insikter om heterogeniteten hos BEV i människokroppen. Det bidrar också till standardiseringen av BEV-separations- och analystekniker.

Protocol

Etikkommittén vid Nanfang Hospital, Southern Medical University, sanktionerade denna studie, som genomfördes med deltagarnas informerade samtycke. Alla metoder som används häri följde de standardriktlinjer som tillhandahålls av International Human Microbiome Standards (IHMS: http://www.microbiome-standards.org/). Alla efterföljande vätskehanteringsprocedurer var obligatoriska att utföras i ett biosäkerhetsskåp eller en ultraren bänk. 1. Insamling och alikvotering av fekala pr…

Representative Results

Bestäm fördelningen av BEV-anrikade fraktionerFör att bestämma fördelningen av bakteriella extracellulära vesiklar (BEV)-berikade fraktioner upprättades en blankkontroll för att mäta absorbansvärdena vid OD 340 nm, och densiteten för varje fraktion beräknades baserat på mätningarna och jodixanolriktlinjerna (steg 8.1). Tabell 2 visar densitetsresultaten och visar att fraktionerna F4 till F9 uppvisade densiteter inom det intervall som vanligtvis förknippas med extracell…

Discussion

Bakteriella extracellulära vesiklar (BEV) är lipid-dubbelskiktsnanopartiklar som utsöndras av bakterier, som bär på en mängd proteiner, lipider, nukleinsyror och andra bioaktiva molekyler, vilket bidrar till att förmedla bakteriernas funktionella effekter20. BEV som härrör från tarmen har verifierats vara involverade i utvecklingen av sjukdomar, såsom inflammatorisk tarmsjukdom, Crohns sjukdom och kolorektal cancer, och påverkar också den allmänna ämnesomsättningen och medierar ned…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöddes av National Science Fund for Distinguished Young Scholars (82025024); Nyckelprojektet för Kinas nationella naturvetenskapliga stiftelse (82230080). Kinas nationella viktiga FoU-program (2021YFA1300604); Kinas nationella naturvetenskapliga stiftelse (81871735, 82272438 och 82002245); Guangdongs naturvetenskapliga fond för framstående unga forskare (2023B1515020058); Naturvetenskapliga stiftelsen i provinsen Guangdong (2021A1515011639). det stora statliga programmet för utveckling av grundforskning vid Natural Science Foundation i Shandongprovinsen i Kina (ZR2020ZD11); Stiftelsen för postdoktoral vetenskap (2022M720059). Outstanding Youths Development Scheme of Nanfang Hospital, Southern Medical University (2022J001).

Materials

1 % (w/v) glutaraldehyde (prepared from 2.5 % stock solution in deionized water) ACMEC AP1126 Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.3
1 % (w/v) methylcellulose (prepared from original powder in deionized water) Sigma-Aldrich M7027 Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.6
1.5 % (w/v) uranyl acetate (prepared from original powder in deionized water) Polysciences 21447-25 Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.5
1000 μL, 200 μL, 10 μL Pipette KIRGEN KG1313, KG1212, KG1011 Transfer the solution
5 % (w/v) bovine serum albumin solution (prepared from the original powder in TBST buffer) Fdbio science FD0030 Used in western blotting for blocking at Step 8.5.6
5 × loading buffer Fdbio science FD006 Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5.1
75 % (v/v) alcohol LIRCON LIRCON-500 mL Surface disinfection
96-well plate Rar A8096 Measure the absorbance values 
Anti-Calnexin antibody Abcam ab92573 Western blotting (Primary Antibody)
Anti-CD63 antibody Abcam ab134045 Western blotting (Primary Antibody)
Anti-CD9 antibody Abcam ab236630 Western blotting (Primary Antibody)
Anti-Flagellin antibody Sino Biological 40067-MM06 Western blotting (Primary Antibody)
Anti-Integrin beta 1 antibody Abcam ab30394 Western blotting (Primary Antibody)
Anti-LPS antibody Thermo Fisher MA1-83152 Western blotting (Primary Antibody)
Anti-LTA antibody Thermo Fisher  MA1-7402 Western blotting (Primary Antibody)
Anti-OmpA antibody CUSABIO CSB-PA359226ZA01EOD, https://www.cusabio.com/ Western blotting (Primary Antibody)
Anti-Syntenin antibody Abcam ab133267 Western blotting (Primary Antibody)
Anti-TSG101 antibody Abcam ab125011 Western blotting (Primary Antibody)
Autoclave ZEALWAY GR110DP Sterilization for supplies and mediums used in the experiment
Balance Mettler Toledo AL104 Balance the tube sample-loaded with PBS
Bicinchoninic acid assay  Fdbio science FD2001 Measure protein content of BEVs at Step 8.2
BioRender BioRender https://app.biorender.com Make the schematic workflow of BEVs isolation and purification showed in Figure 1
Biosafety cabinet Haier HR1200- II B2 Peform the procedures about feces sample handling
Centrifuge 5810 R; Rotor F-34-6-38 Eppendorf 5805000092; 5804727002, adapter: 5804774000 Preprocess for BEVs (Step 3)
Chemiluminescence Apparatus BIO-OI OI600SE-MF Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12
Cytation 5 BioTek F01 Microplate detector for measuring the absorbance (Step 8.1) and fluorescence (Figure 6) values 
Dil-labled low density lipoprotein ACMEC AC12038 Definition of distribution of interfering components 
Electrophoresis equipment Bio-rad 1658033 Used in western blotting for protein separation and transfer at Step 8.5.2, 8.5.3, 8.5.5
Enhanced Chemiluminescence kit HRP  Fdbio science FD8020 Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12
Escherichia coli  American Type Culture Collection ATCC8739 Isolate BEVs as a positive control. Protocol: Dissolve 25 g of the LB powder in 1 L deionized water, and autoclave. Transfer the 800 μL of preserved Escherichia coli into the medium. Cultivate at 37 °C in the incubator shaker. Then centrifuge at 3, 000 × g for 20 min at 4 °C, 12, 000 × g for 30 min at 4 °C, filter the supernatant through 0.22 μm membrane, and perform ultra-speed centrifugation at 160, 000 × g for 70 min at 4 °C. Pellet defined as crude BEVs from Escherichia coli was suspended in 1.2 mL PBS (Step 3, 4).    
Falcon tubes 50 mL KIRGEN KG2811 Preprocess for BEVs (Step 3)
Feto Protein Staining Buffer Absci ab.001.50 Coomassie brilliant blue staining at Step 8.5.4
Filter paper Biosharp BS-TFP-070B Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 (Blotting the solution)
Formvar/Carbon supported copper grids  Sigma-Aldrich TEM-FCF200CU50 Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3
HEPES powder Meilunbio MB6078 Prepare iodixanol buffers with different concentrations for density gradient centrifugation
HRP AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Fdbio science FDM007 Western blotting (Secondary Antibody)
HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Fdbio science FDR007 Western blotting (Secondary Antibody)
Incubator shaker Qiangwen DHZ-L Cultivate Escherichia coli 
Kimwipes™ Delicate Task Wipes Kimtech Science 34155 Wipe the inner wall of the ultracentrifuge tube at Step 4.15
LB broth Hopebio HB0128 Cultivate Escherichia coli 
Low temperature freezer (-80 °C) Haier DW-86L338J Store the samples
Methanol Alalddin M116118 Used in western blotting for activating PVDF membrane at Step 8.5.5
Micro tubes 1.5 mL KIRGEN KG2211 Recover fractions after density gradient centrifugation
Micro tubes 2 mL KIRGEN KG2911 Recover fractions after density gradient centrifugation
Micro tubes 5 mL BBI F610888-0001 Recover fractions after density gradient centrifugation
Microplate reader  Thermo Fisher  Multiskan MK3 Measure protein content of BEVs at Step 8.2
Millipore filter 0.22 μm Merck millipore SLGP033RB Filtration sterilization; Material: polyethersulfone, PES
NaCl GHTECH 1.01307.040 Density gradient centrifugation solution
NaOH GHTECH 1.01394.068 Density gradient centrifugation solution (pH adjustment)
Optima™ XPN-100 Beckman Coulter A94469 Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7
OptiPrep™ Serumwerk Bernburg AG 1893 Density gradient centrifugation stock solution
Orbital Shaker Youning CS-100 Dissolve feces at Step 2
Phosphate buffered saline Procell PB180327 Dissolve feces at Step 2
Pipettor Eppendorf 3120000267, 3120000259 Transfer the solution
Plastic pasteur pipette ABCbio ABC217003-4 Remove supernatant in preprocessing at Step 3.4
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes Millipore ISEQ00010, IPVH00010 Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5
Prefabricated polyacrylamide gel, 4–20% 15 Wells ACE F15420Gel Used in western blotting for protein separation at Step 8.5.2, 8.5.3
Primary antibody diluent Fdbio science FD0040 Used in western blotting at Step 8.5.8
Protein ladder Fdbio science FD0672 Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5
Rapid protein blotting solution UBIO UW0500 Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5
Rotor SW 32 Ti Swinging-Bucket Rotor Beckman Coulter 369650 Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7
Syringe 20 mL, 50 mL  Jetway ZSQ-20ML, YCXWJZSQ-50 mL Transfer buffers amd remove supernatant in preprocessing
TBS powder Fdbio science FD1021 Used in western blotting at Step 8.5
Transmission electron microscope (TEM) Hitachi  H-7650 Morphological observation for BEVs at Step 8.3
Tween-20 Fdbio science FD0020 Used in western blotting at Step 8.5
Ultracentrifuge tube Beckman 326823, 355642 Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7
Ultra-clean bench AIRTECH SW-CJ-2FD Peform the procedures about liquid handling
Water bath Bluepard CU600 Used for measuring protein content of BEVs at Step 8.2.5
ZetaView Particle Metrix S/N 21-734, Software ZetaView (version 8.05.14 SP7) Nanoparticle tracking analysis (NTA) for measuring the particle size and concentrarion of BEVs at Step 8.4

References

  1. Costello, E. K., et al. Bacterial community variation in human body habitats across space and time. Science. 326 (5960), 1694-1697 (2009).
  2. Greenhalgh, K., Meyer, K. M., Aagaard, K. M., Wilmes, P. The human gut microbiome in health: establishment and resilience of microbiota over a lifetime. Environmental Microbiology. 18 (7), 2103-2116 (2016).
  3. de Vos, W. M., Tilg, H., Van Hul, M., Cani, P. D. Gut microbiome and health: mechanistic insights. Gut. 71 (5), 1020-1032 (2022).
  4. Zhou, P., Yang, D., Sun, D., Zhou, Y. Gut microbiome: New biomarkers in early screening of colorectal cancer. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 36 (5), 24359 (2022).
  5. Paik, D., et al. Human gut bacteria produce Τ(Η)17-modulating bile acid metabolites. Nature. 603 (7903), 907-912 (2022).
  6. Parada Venegas, D., et al. Short chain fatty acids (SCFAs)-mediated gut epithelial and immune regulation and its relevance for inflammatory bowel diseases. Frontiers in Immunology. 10, 277 (2019).
  7. Jiang, C., Li, G., Huang, P., Liu, Z., Zhao, B. The Gut microbiota and Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimer’s Disease. 58 (1), 1-15 (2017).
  8. Morais, L. H., Schreiber, H. L. t., Mazmanian, S. K. The gut microbiota-brain axis in behaviour and brain disorders. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 241-255 (2021).
  9. Kim, J. H., Lee, J., Park, J., Gho, Y. S. Gram-negative and Gram-positive bacterial extracellular vesicles. Seminars in Cell and Developmental Biology. 40, 97-104 (2015).
  10. Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. Types and origins of bacterial membrane vesicles. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).
  11. Xie, J., Li, Q., Haesebrouck, F., Van Hoecke, L., Vandenbroucke, R. E. The tremendous biomedical potential of bacterial extracellular vesicles. Trends in Biotechnology. 40 (10), 1173-1194 (2022).
  12. Coumans, F. A. W., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).
  13. Northrop-Albrecht, E. J., Taylor, W. R., Huang, B. Q., Kisiel, J. B., Lucien, F. Assessment of extracellular vesicle isolation methods from human stool supernatant. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (4), 12208 (2022).
  14. Park, Y. E., et al. Microbial changes in stool, saliva, serum, and urine before and after anti-TNF-α therapy in patients with inflammatory bowel diseases. Scientific Reports. 12 (1), 6359 (2022).
  15. Tulkens, J., De Wever, O., Hendrix, A. Analyzing bacterial extracellular vesicles in human body fluids by orthogonal biophysical separation and biochemical characterization. Nature Protocols. 15 (1), 40-67 (2020).
  16. Tulkens, J., et al. Increased levels of systemic LPS-positive bacterial extracellular vesicles in patients with intestinal barrier dysfunction. Gut. 69 (1), 191-193 (2020).
  17. Kang, C. S., et al. Extracellular vesicles derived from gut microbiota, especially Akkermansia muciniphila, protect the progression of dextran sulfate sodium-induced colitis. PloS one. 8 (10), 76520 (2013).
  18. Simonsen, J. B. What are we looking at? Extracellular vesicles, lipoproteins, or both. Circulation Research. 121 (8), 920-922 (2017).
  19. Correll, V. L., et al. Optimization of small extracellular vesicle isolation from expressed prostatic secretions in urine for in-depth proteomic analysis. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12184 (2022).
  20. Liang, X., et al. Gut bacterial extracellular vesicles: important players in regulating intestinal microenvironment. Gut Microbes. 14 (1), 2134689 (2022).
  21. Alberti, G., et al. Extracellular vesicles derived from gut microbiota in inflammatory bowel disease and colorectal cancer. Biomedical papers of the Medical Faculty of the University Palacky, Olomouc, Czech Republic. 165 (3), 233-240 (2021).
  22. Díez-Sainz, E., Milagro, F. I., Riezu-Boj, J. I., Lorente-Cebrián, S. Effects of gut microbiota-derived extracellular vesicles on obesity and diabetes and their potential modulation through diet. Journal of Physiology and Biochemistry. 78 (2), 485-499 (2022).
  23. Lajqi, T., et al. Gut microbiota-derived small extracellular vesicles endorse memory-like inflammatory responses in murine neutrophils. Biomedicines. 10 (2), 442 (2022).
  24. Lee, K. E., et al. The extracellular vesicle of gut microbial Paenalcaligenes hominis is a risk factor for vagus nerve-mediated cognitive impairment. Microbiome. 8 (1), 107 (2020).
  25. Villard, A., Boursier, J., Andriantsitohaina, R. Bacterial and eukaryotic extracellular vesicles and nonalcoholic fatty liver disease: new players in the gut-liver axis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 320 (4), G485-G495 (2021).
  26. Wei, S., et al. Outer membrane vesicles enhance tau phosphorylation and contribute to cognitive impairment. Journal of Cellular Physiology. 235 (5), 4843-4855 (2020).
  27. Bitto, N. J., Kaparakis-Liaskos, M. Methods of bacterial membrane vesicle production, purification, quantification, and examination of their immunogenic functions. Methods in Molecular Biology. 2523, 43-61 (2022).
  28. Stentz, R., Miquel-Clopés, A., Carding, S. R. Production, isolation, and characterization of bioengineered bacterial extracellular membrane vesicles derived from Bacteroides thetaiotaomicron and their use in vaccine development. Methods in Molecular Biology. 2414, 171-190 (2022).
  29. Zhang, Q., Jeppesen, D. K., Higginbotham, J. N., Franklin, J. L., Coffey, R. J. Comprehensive isolation of extracellular vesicles and nanoparticles. Nature Protocols. 18 (5), 1462-1487 (2023).
  30. Iwai, K., Minamisawa, T., Suga, K., Yajima, Y., Shiba, K. Isolation of human salivary extracellular vesicles by iodixanol density gradient ultracentrifugation and their characterizations. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 30829 (2016).
  31. Vandeputte, D., et al. Stool consistency is strongly associated with gut microbiota richness and composition, enterotypes and bacterial growth rates. Gut. 65 (1), 57-62 (2016).
  32. Wen, M., et al. Bacterial extracellular vesicles: A position paper by the Microbial Vesicles Task Force of the Chinese Society of Extracellular Vesicles. Interdisciplinary Medicine. 1, 12046 (2023).

Play Video

Cite This Article
Xue, Y., Huang, X., Ou, Z., Wu, Y., Li, Q., Huang, X., Wen, M., Yang, Y., Situ, B., Zheng, L. Isolation and Purification of Bacterial Extracellular Vesicles from Human Feces Using Density Gradient Centrifugation. J. Vis. Exp. (199), e65574, doi:10.3791/65574 (2023).

View Video