Hyperglykemisk klämma och hypoglykemisk klämma hos medvetna möss
Summary
En hyperglykemisk klämma används för att mäta insulinfrisättningen med bibehållen högre blodsockerkoncentration. En hypoglykemisk klämma är till för att mäta glukosproduktion inducerad av motreglerande svar. Båda metoderna använder samma kirurgiska ingrepp. Här presenterar vi en klämteknik för att bedöma systemisk glukosmetabolism.
Abstract
Diabetes mellitus (DM) orsakas av otillräcklig insulinfrisättning från bukspottkörtelns β-celler (Typ1 DM) och insulinkänslighet i muskler, lever och fettvävnad (Typ2 DM). Insulininjektion behandlar DM-patienter men leder till hypoglykemi som biverkning. Kortisol och katekolaminer frisätts för att aktivera glukosproduktionen från levern för att återställa hypoglykemi, så kallad kontraregulatorisk respons (CRR). I DM-forskning med gnagarmodeller används glukostoleranstester och 2-deoxi-glukosinjektion för att mäta insulinfrisättning respektive CRR. Blodglukoskoncentrationerna förändras dock ihållande under experimenten, vilket gör det svårt att bedöma nettoinsulinfrisättning och CRR. Den här artikeln beskriver en metod där blodsockret hålls på 250 mg/dL eller 50 mg/dL hos medvetna möss för att jämföra frisättningen av insulin respektive CRR-hormoner.
Polyetylenslang implanteras i mössens halspulsåder och halsven, och mössen får återhämta sig från operationen. Jugularvenslangen är ansluten till en Hamilton-spruta med en sprutpump för att möjliggöra insulin- eller glukosinfusion med en konstant och variabel hastighet. Halspulsåderslangen är till för bloduppsamling. För den hyperglykemiska klämman infunderas 30 % glukos i venen, och blodsockernivåerna mäts från artärblodet var 5:e minut eller 10:e minut. Infusionshastigheten på 30 % glukos ökas tills blodsockernivån blir 250 mg/dL. Blod samlas in för att mäta insulinkoncentrationen. Vid hypoglykemisk klämma infunderas 10 mU/kg/min insulin tillsammans med 30 % glukos, vars infusionshastighet är variabel för att upprätthålla 50 mg/dL blodsockernivå. Blod samlas in för att mäta motreglerande hormoner när både glukosinfusion och blodsocker når ett stabilt tillstånd. Både hyperglykemiska och hypoglykemiska klämmor har samma kirurgiska ingrepp och experimentella uppställningar. Metoden är därför användbar för forskare inom systemisk glukosmetabolism.
Introduction
Glukos är en viktig energikälla för cellerna, och brist på glukos kan leda till en mängd olika symtom och komplikationer. I händelse av lågt glukos (hypoglykemi, i allmänhet mindre än 70 mg/dL i fasteblodsockernivån, men bör inte bestämmas av ett enda värde1), är de vanligaste symtomen svaghet, förvirring, svettning och huvudvärk. Det kan också störa hjärnfunktionen och öka risken för kardiovaskulära händelser och dödlighet2. Omvänt är hyperglykemi ett medicinskt tillstånd där plasmaglukoskoncentrationen överstiger normala nivåer (vanligtvis > 126 mg/dL i fasteblodsockernivå3). Detta kan inträffa hos personer med diabetes som antingen har ett underskott i insulinproduktion eller insulinutnyttjande. Hyperglykemi kan leda till diabetisk ketoacidos, som uppstår när kroppen inte kan använda glukos som energi utan istället bryter ner fettsyror som bränsle. Det hyperglykemiska hyperosmolära tillståndet ökar också dödligheten4. Långvarig hyperglykemi kan orsaka skador på blodkärl, nerver och organ, vilket leder till utveckling av flera kroniska komplikationer som hjärt- och kärlsjukdomar, retinopatier och njursjukdomar. Således måste blodsockerkoncentrationen hållas i ett snävt intervall mellan 100 mg/dL och 120 mg/dL.
Blodsockret regleras av balansen mellan glukostillförsel och glukosutmatning i en enkompartmentmodell (figur 1A). Glukostillförsel inkluderar absorberad glukos från mat och glukosproduktion från levern, njurarna och tunntarmen. Glukosproduktionen består av glukosupptag i vävnader och glukosavsättning från njurarna. Både mängden glukos som tillförs och produceras regleras av endokrina hormoner. Till exempel frigörs glukagon, kortikosteron och katekolaminer, kända som motreglerande hormoner, när blodsockernivåerna sjunker5. De stimulerar nedbrytningen av glykogen och syntesen av glukos, främst från levern; Dessa processer kallas glykogenolys respektive glukoneogenes. Hyperglykemi ökar insulinfrisättningen från bukspottkörtelns β-celler och stimulerar glukosupptaget i muskler, fettvävnad och hjärta 6,7,8,9. Motion ökar det insulinoberoende glukosupptaget10. Det sympatiska nervsystemet ökar glukosupptaget i muskler och brun fettvävnad 6,11. För att mäta förmågan att reglera glukosmetabolismen i perifera vävnader använder forskare vanligtvis glukostoleranstestet (GTT) och insulintoleranstestet (ITT) (Figur 1B,C). I GTT måste två faktorer beaktas: insulinfrisättning och insulinkänslighet (figur 1B). Glukoskoncentrationskurvan under 120-minuterstestet är dock olika i varje mus, vilket kan påverka olika mängder hormonfrisättning. Vid ITT regleras blodsockret av både insulinkänslighet och frisättning av motreglerande hormoner. Därför är det svårt att fastställa den exakta innebörden av glukosmetabolism, insulinfrisättning och insulinkänslighet i GTT och ITT, i situationer där blodsockernivåerna inte är konstanta.
För att övervinna dessa problem är det önskvärt att hålla blodsockret på en konstant nivå (eller “klämma”). Vid hyperglykemisk klämma infunderas glukos i blodomloppet för att höja blodsockernivåerna till en viss nivå och bibehålls sedan på den nivån under en viss tid. Mängden infunderad glukos justeras baserat på mätningar av blodsockernivåer var 5-10:e minut för att upprätthålla ett stabilt tillstånd. Denna teknik är särskilt användbar för att förstå parametrarna för insulinutsöndring vid en fastspänd glukosnivå. Hypoglykemisk klämma är en metod för att upprätthålla låga blodsockernivåer genom att tillföra insulin. Glukos infunderas i varierande takt för att upprätthålla en specifik blodsockernivå. Om musen inte kan återhämta sig från hypoglykemi bör mer glukos tillföras.
Även om det finns många fördelar med att utföra hyperglykemiska och hypoglykemiska klämmor, anses de kirurgiska och experimentella ingreppen vara tekniskt svåra. Det är alltså få forskargrupper som har kunnat göra dem. Vi syftade till att beskriva dessa metoder för att forskare med ekonomiska och arbetskraftsmässiga begränsningar ska kunna starta dessa experiment till en lägre budget.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden som beskrivs här är enkel och kan göras med pipettspetsar, sprutor och andra föremål som finns i vanliga laboratorier. Även om forskare kan behöva köpa ytterligare slangar och pumpar behövs ingen dyr utrustning. Således är detta protokoll för kateterisering och klämma lättare att starta jämfört med tidigare rapporter 12,13,14.
Klämtekniken utvecklades runt 1970 och har använt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Leading Initiative for Excellent Young Researchers (från MEXT); Ett bidrag till vetenskaplig forskning (B) (bidrag nr JP21H02352). Japans byrå för medicinsk forskning och utveckling (AMED-RPIME, anslagsnummer JP21gm6510009h0001, JP22gm6510009h9901); Uehara Memorial Foundation; Astellas stiftelse för forskning om metabola sjukdomar; Suzuken Memorial Foundation, Akiyama Life Science Foundation och Narishige Neuroscience Research Foundation. Vi tackar också Nur Farehan Asgar, Ph.D, för att ha redigerat ett utkast av detta manuskript.
Materials
| Adhesive glue | Henkel AG & Co. KGaA | LOCTITE 454 | |
| ELISA kit (C-peptide) | Morinaga Institute of Bilogical Science Inc | M1304 | Mouse C-peptide ELISA Kit |
| ELISA kit (insulin) | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 633-03411 | LBIS Mouse Insulin ELISA Kit (U-type) |
| Handy glucose meter | Nipro Co. | 11-777 | Free Style Freedom Lite |
| Insulin (100U/ml) | Eli Lilly & Co. | 428021014 | Humulin R (100U/ml) |
| Mouse | Japan SLC Inc. | C57BL/6NCrSlc | C57BL |
| Suture | Natsume seisakusho | C-23S-560 No.2 | Sterilized |
| Syringe Pump | Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| Synthetic suture | VÖMEL | HR-17 | |
| Tubing1 | AS ONE Corporation | 9-869-01 | LABORAN(R) Silicone Tube |
| Tubing2 | Fisher Scientific | 427400 | BD Intramedic PE Tubing |
| Tubing3 | IGARASHI IKA KOGYO CO., LTD. | size5 | Polyethylene tubing size5 |
References
- Seaquist, E. R., et al. Hypoglycemia and diabetes: A report of a workgroup of the american diabetes association and the endocrine society. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98 (5), 1845-1859 (2013).
- Amiel, S. A., et al. Hypoglycaemia, cardiovascular disease, and mortality in diabetes: epidemiology, pathogenesis, and management. The Lancet Diabetes and Endocrinology. 7 (5), 385-396 (2019).
- . Leanne Riley Mean fasting blood glucose Available from: https://www.who.int/data/gho/indicator-metadata-registry/imr-details/2380 (2022)
- Umpierrez, G., Korytkowski, M. Diabetic emergencies-ketoacidosis, hyperglycaemic hyperosmolar state and hypoglycaemia. Nature Reviews Endocrinology. 12 (4), 222-232 (2016).
- Sprague, J. E., Arbeláez, A. M. Glucose counterregulatory responses to hypoglycemia. Pediatric Endocrinology Reviews. 9 (1), 463-473 (2011).
- Toda, C., et al. Distinct effects of leptin and a melanocortin receptor agonist injected into medial hypothalamic nuclei on glucose uptake in peripheral tissues. Diabetes. 58 (12), 2757-2765 (2009).
- Toda, C., et al. Extracellular signal-regulated kinase in the ventromedial hypothalamus mediates leptin-Induced glucose uptake in red-type skeletal muscle. Diabetes. 62 (7), 2295-2307 (2013).
- Toda, C., Kim, J. D., Impellizzeri, D., Cuzzocrea, S., Liu, Z. -. W., Diano, S. UCP2 regulates mitochondrial fission and ventromedial nucleus control of glucose responsiveness. Cell. 164 (5), 872-883 (2016).
- Lee, M. L., et al. Prostaglandin in the ventromedial hypothalamus regulates peripheral glucose metabolism. Nature Communications. 12 (1), 2330 (2021).
- Jessen, N., Goodyear, L. J. Contraction signaling to glucose transport in skeletal muscle. Journal of Applied Physiology. 99 (1), 330-337 (2005).
- Shiuchi, T., et al. Induction of glucose uptake in skeletal muscle by central leptin is mediated by muscle β2-adrenergic receptor but not by AMPK. Scientific Reports. 7 (1), 15141 (2017).
- Ayala, J. E., et al. Hyperinsulinemic-euglycemic clamps in conscious, unrestrained mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 57, e3188 (2011).
- Hughey, C. C., Hittel, D. S., Johnsen, V. L., Shearer, J. Hyperinsulinemic-euglycemic clamp in the conscious rat. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 48, e2432 (2010).
- Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55 (2), 390-397 (2006).
- DeFronzo, R. A., Soman, V., Sherwin, R. S., Hendler, R., Felig, P. Insulin binding to monocytes and insulin action in human obesity, starvation, and refeeding. Journal of Clinical Investigation. 62 (1), 204-213 (1978).
- Czech, M. P. Insulin action and resistance in obesity and type 2 diabetes. Nature Medicine. 23 (7), 804-814 (2017).
- Saisho, Y. β-cell dysfunction: Its critical role in prevention and management of type 2 diabetes. World Journal of Diabetes. 6 (1), 109 (2015).
- Mittendorfer, B., Patterson, B. W., Smith, G. I., Yoshino, M., Klein, S. β Cell function and plasma insulin clearance in people with obesity and different glycemic status. Journal of Clinical Investigation. 132 (3), 154068 (2022).
- Nchienzia, H., et al. Hedgehog interacting protein (Hhip) regulates insulin secretion in mice fed high fat diets. Scientific reports. 9 (1), 11183 (2019).
- Tomita, T., Doull, V., Pollock, H. G., Krizsan, D. Pancreatic islets of obese hyperglycemic mice (ob/ob). Pancreas. 7 (3), 367-375 (1992).
- Uchida, K., et al. Lack of TRPM2 impaired insulin secretion and glucose metabolisms in mice. Diabetes. 60 (1), 119-126 (2011).
- Zhu, Y. X., Zhou, Y. C., Zhang, Y., Sun, P., Chang, X. A., Han, X. Protocol for in vivo and ex vivo assessments of glucose-stimulated insulin secretion in mouse islet β cells. STAR Protocols. 2 (3), 100728 (2021).
- Moullé, V. S. Autonomic control of pancreatic beta cells: What is known on the regulation of insulin secretion and beta-cell proliferation in rodents and humans. Peptides. 148, 170709 (2022).
- Honzawa, N., Fujimoto, K., Kitamura, T. Cell autonomous dysfunction and insulin resistance in pancreatic α cells. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3699 (2019).
- Siddiqui, A., Madhu, S. V., Sharma, S. B., Desai, N. G. Endocrine stress responses and risk of type 2 diabetes mellitus. Stress. 18 (5), 498-506 (2015).
- Chan, O., Sherwin, R. Influence of VMH fuel sensing on hypoglycemic responses. Trends in Endocrinology & Metabolism. 24 (12), 616-624 (2013).
- Donovan, C. M., Watts, A. G. Peripheral and central glucose sensing in hypoglycemic detection. Physiology. 29 (5), 314-324 (2014).
- TeSlaa, T., et al. The source of glycolytic intermediates in mammalian tissues. Cell Metabolism. 33 (2), 367-378.e5 (2021).
