Glucoseproductie in de lever, ureagenese en lipolyse gekwantificeerd met behulp van het geperfuseerde levermodel van muizen
Summary
Hier presenteren we een robuuste methode voor in situ perfusie van de muizenlever om de acute en directe regulatie van het levermetabolisme te bestuderen zonder de leverarchitectuur te verstoren, maar in afwezigheid van extra-hepatische factoren.
Abstract
De lever heeft tal van functies, waaronder het metabolisme van voedingsstoffen. In tegenstelling tot andere in vitro en in vivo modellen van leveronderzoek, maakt de geïsoleerde geperfuseerde lever de studie van de leverbiologie en het metabolisme in de hele lever mogelijk met een intacte leverarchitectuur, gescheiden van de invloed van extra-hepatische factoren. Leverperfusies zijn oorspronkelijk ontwikkeld voor ratten, maar de methode is ook aangepast aan muizen. Hier beschrijven we een protocol voor in situ perfusie van de muizenlever. De lever wordt antegrade geperfundeerd door de poortader met zuurstofrijke Krebs-Henseleit bicarbonaatbuffer, en de output wordt verzameld uit de suprahepatische inferieure vena cava met klemming van de infrahepatische inferieure vena cava om het circuit te sluiten. Met behulp van deze methode kunnen de directe levereffecten van een teststof worden geëvalueerd met een gedetailleerde tijdresolutie. De leverfunctie en levensvatbaarheid zijn stabiel gedurende ten minste 3 uur, waardoor interne controles in hetzelfde experiment kunnen worden opgenomen. De experimentele mogelijkheden met behulp van dit model zijn talrijk en kunnen inzicht geven in leverfysiologie en leverziekten.
Introduction
De lever is een essentieel orgaan in de stofwisseling. Het speelt een sleutelrol bij de controle van de energiebalans van het hele lichaam door het glucose-, lipiden- en aminozuurmetabolisme te reguleren. De toename van leverziekten wereldwijd ontpopt zich als een grote wereldwijde gezondheidslast en er is meer kennis nodig over de pathofysiologie en de gevolgen daarvan voor de leverfuncties.
Er zijn verschillende in vitro modellen ontwikkeld voor onderzoek op de lever als aanvulling op in vivo studies. Geïsoleerde en gekweekte primaire hepatocyten van knaagdieren en mensen worden veel gebruikt. Niet-parenchymale cellen kunnen worden gescheiden van hepatocyten met behulp van differentiële en gradiëntcentrifugatie, en de co-cultuur van verschillende celtypen is nuttig voor het bestuderen van intercellulaire overspraak1. Hoewel primaire menselijke hepatocyten worden beschouwd als de gouden standaard voor het testen van de toxiciteit van geneesmiddelen, hebben verschillende onderzoeken aangetoond dat de hepatocyten snel dedifferentiëren in weefselkweek, wat resulteert in verlies van leverfuncties 2,3,4. Hepatocytenkweek in een 3D-sferoïde systeem verbetert de dedifferentiatie, is stabieler en lijkt de lever in vivo in hogere mate na te bootsen dan de traditionele 2D-kweeksystemen. Nauwkeurig gesneden leverplakken zijn een ander goed ingeburgerd in-vitromodel dat de weefselarchitectuur intact houdt en de niet-parenchymale cellen bevat die in de lever aanwezig zijn6. Meer geavanceerde in vitro modellen zijn onder meer lever-op-een-chip7 en leverorganoïden8. Bij al deze benaderingen is er echter een verlies van structurele integriteit en stromingsdynamiek, inclusief vectoriële portale leveraderstroom, wat waarschijnlijk van invloed is op de generaliseerbaarheid.
De geïsoleerde geperfuseerde rattenlever werd voor het eerst beschreven door Claude Bernard in 18559 en wordt nog steeds gebruikt op verschillende wetenschappelijke gebieden voor studies van leverbiologie, toxicologie en pathofysiologie. Voordelen van de geperfuseerde lever ten opzichte van de bovengenoemde in vitro modellen zijn onder meer het behoud van de leverarchitectuur, de vasculaire flow, de polariteit en zonering van de hepatocyten, en de interacties tussen hepatocyten en niet-parenchymale cellen. In vergelijking met in vivo studies maakt de geperfuseerde lever het mogelijk om het levermetabolisme op een geïsoleerde manier te bestuderen, waarbij extra-hepatische factoren die door het bloed worden gedragen, worden vermeden en met volledige controle over de experimentele omstandigheden. Er zijn in de loop der jaren verschillende wijzigingen aangebracht om het perfusiemodel van de lever van ratten te verbeteren10,11,12,13. Hoewel muizen zijn gebruikt voor geïsoleerde geperfuseerde leverstudies, is er minder literatuur beschikbaar. Hier presenteren we een methode voor in situ perfusie van de muizenlever door canulatie van de poortader en de suprahepatische vena cava inferior om de acute en directe metabole reacties op metabole substraten en hormonen te bestuderen zoals gemeten in het hepatische veneuze effluent van de muizenlever in real-time.
Protocol
Representative Results
Discussion
De geïsoleerde geperfuseerde muizenlever is een sterk onderzoeksinstrument voor studies van de dynamiek en moleculaire mechanismen van het levermetabolisme. De mogelijkheid om monsters van minuut tot minuut te nemen, biedt een gedetailleerde evaluatie van het directe effect van een teststof op de lever. In vergelijking met in vivo studies stelt de geperfuseerde lever ons in staat om het levermetabolisme op een geïsoleerde manier te bestuderen, waarbij extra-hepatische factoren die door het bloed worden gedrage…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De studies en Nicolai J. Wewer Albrechtsen werden ondersteund door Novo Nordisk Foundation Excellence Emerging Investigator Grant – Endocrinology and Metabolism (Application No. NNF19OC0055001), European Foundation for the Study of Diabetes Future Leader Award (NNF21SA0072746) en Independent Research Fund Denmark, Sapere Aude (1052-00003B). Novo Nordisk Foundation Center for Protein Research wordt financieel ondersteund door de Novo Nordisk Foundation (Grant agreement NNF14CC0001). Figuur 1B is gemaakt met biorender.com. We danken Dr. Rune E. Kuhre (Novo Nordisk A/S) voor vruchtbare discussies over de geperfuseerde muizenlever.
References
- Bale, S. S., Geerts, S., Jindal, R., Yarmush, M. L. Isolation and co-culture of rat parenchymal and non-parenchymal liver cells to evaluate cellular interactions and response. Scientific Reports. 6, 25329 (2016).
- Lauschke, V. M., et al. Massive rearrangements of cellular MicroRNA signatures are key drivers of hepatocyte dedifferentiation. Hepatology. 64 (5), 1743-1756 (2016).
- Seirup, M., et al. Rapid changes in chromatin structure during dedifferentiation of primary hepatocytes in vitro. Genomics. 114 (3), 110330 (2022).
- Gupta, R., et al. Comparing in vitro human liver models to in vivo human liver using RNA-Seq. Archive of Toxicology. 95 (2), 573-589 (2021).
- Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function, and disease. Scientific Reports. 6, 25187 (2016).
- Dewyse, L., Reynaert, H., van Grunsven, L. A. Best practices and progress in precision-cut liver slice cultures. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 7137 (2021).
- Li, X., George, S. M., Vernetti, L., Gough, A. H., Taylor, D. L. A glass-based, continuously zonated and vascularized human liver acinus microphysiological system (vLAMPS) designed for experimental modeling of diseases and ADME/TOX. Lab on a Chip. 18 (17), 2614-2631 (2018).
- Broutier, L., et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocols. 11 (9), 1724-1743 (2016).
- Bartošek, I., Guaitani, A., Miller, L. L. . Isolated Liver Perfusion and its Applications. , (1973).
- Gores, G. J., Kost, L. J., LaRusso, N. F. The isolated perfused rat liver: conceptual and practical considerations. Hepatology. 6 (3), 511-517 (1986).
- Mischinger, H. J., et al. An improved technique for isolated perfusion of rat livers and an evaluation of perfusates. Journal of Surgical Research. 53 (2), 158-165 (1992).
- Vairetti, M., et al. Correlation between the liver temperature employed during machine perfusion and reperfusion damage: role of Ca2. Liver Transplantation. 14 (4), 494-503 (2008).
- Ferrigno, A., Richelmi, P., Vairetti, M. Troubleshooting and improving the mouse and rat isolated perfused liver preparation. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 107-114 (2013).
- Zawada, R. J. X., Kwan, P., Olszewski, K. L., Llinas, M., Huang, S. -. G. Quantitative determination of urea concentrations in cell culture medium. Biochemistry and Cell Biology. 87 (3), 541-544 (2009).
