ייצור גלוקוז בכבד, אורגנזה וליפוליזה מכומתים באמצעות מודל הכבד של עכבר מחורר
Summary
כאן, אנו מציגים שיטה חזקה עבור זילוח באתרו של כבד העכבר כדי ללמוד את הרגולציה החריפה והישירה של חילוף החומרים בכבד מבלי להפריע לארכיטקטורה הכבדית אלא בהיעדר גורמים מחוץ לכבד.
Abstract
לכבד יש תפקידים רבים, כולל מטבוליזם של חומרים מזינים. בניגוד למודלים אחרים של חקר הכבד במבחנה ו-in vivo , הכבד המבודד מחורר מאפשר ללמוד ביולוגיה של הכבד ומטבוליזם בכבד כולו עם ארכיטקטורה כבדית שלמה, המופרדת מהשפעת גורמים חוץ-כבדיים. זילוח כבד פותח במקור עבור חולדות, אך השיטה הותאמה גם לעכברים. כאן אנו מתארים פרוטוקול לזילוח באתרו של כבד העכבר. הכבד מחורר באופן מקדים דרך וריד הפורטל עם חיץ קרבס-הנסלייט ביקרבונט מחומצן, והפלט נאסף מהווריד הנבוב התחתון העל-כבד עם הידוק של הווריד הנבוב התחתון האינפרא-הפטי כדי לסגור את המעגל. באמצעות שיטה זו, ההשפעות הכבדיות הישירות של מתחם הבדיקה ניתן להעריך עם רזולוציית זמן מפורטת. תפקוד הכבד והכדאיות יציבים למשך 3 שעות לפחות, ומאפשרים הכללת בקרות פנימיות באותו ניסוי. אפשרויות הניסוי באמצעות מודל זה הן רבות ועשויות להסיק תובנה לגבי פיזיולוגיה של הכבד ומחלות כבד.
Introduction
הכבד הוא איבר חיוני בחילוף החומרים. הוא ממלא תפקיד מפתח בשליטה על מאזן האנרגיה של כל הגוף על ידי ויסות חילוף החומרים של גלוקוז, שומנים וחומצות אמינו. העלייה במחלות כבד ברחבי העולם מסתמנת כנטל בריאותי עולמי גדול, ויש צורך בידע נוסף על הפתופיזיולוגיה והשלכותיה על תפקודי הכבד.
מודלים שונים במבחנה פותחו למחקר על הכבד כדי להשלים מחקרי in vivo. הפטוציטים ראשוניים מבודדים ומתורבתים ממכרסמים ובני אדם נמצאים בשימוש נרחב. תאים שאינם פרנכימליים יכולים להיות מופרדים מהפטוציטים באמצעות צנטריפוגה דיפרנציאלית והדרגתית, והתרבות המשותפת של סוגי תאים שונים שימושית לחקר crosstalkבין-תאי 1. למרות שהפטוציטים האנושיים הראשוניים נחשבים לתקן הזהב לבדיקת רעילות תרופות, מספר מחקרים הראו כי הפטוציטים מתמיינים במהירות בתרבית רקמה וכתוצאה מכך מאבדים תפקודי כבד 2,3,4. תרבית הפטוציטים במערכת ספרואידית תלת-ממדית משפרת את הדיפרנציאציה, יציבה יותר, ונראה כי היא מחקה את הכבד in vivo במידה גבוהה יותר מאשר מערכות התרבית הדו-ממדיות המסורתיות5. פרוסות כבד חתוכות במדויק הן מודל מבוסס היטב נוסף במבחנה השומר על ארכיטקטורת הרקמה שלמה ומכיל את התאים הלא פרנכימליים הנמצאים בכבד6. מודלים מתקדמים יותר במבחנה כוללים כבד על שבב7 ואורגנואידים בכבד8. עם זאת, עם כל הגישות הללו, יש אובדן של שלמות מבנית ודינמיקה זרימה, כולל זרימת ורידים פורטליים-כבדיים וקטוריאליים, אשר ככל הנראה משפיע על הכללה.
כבד החולדה המבודד תואר לראשונה על ידי קלוד ברנרד בשנת 18559, והוא עדיין משמש בתחומים מדעיים שונים למחקרים בביולוגיה של הכבד, טוקסיקולוגיה ופתופיזיולוגיה. היתרונות של הכבד המחורר בהשוואה למודלים במבחנה שהוזכרו לעיל כוללים שמירה על ארכיטקטורת הכבד, זרימת כלי הדם, קוטביות הפטוציטים והאזור, והאינטראקציות בין הפטוציטים לתאים שאינם פרנכימליים. בהשוואה למחקרי in vivo, הכבד המחורר מאפשר ללמוד את חילוף החומרים בכבד באופן מבודד תוך הימנעות מגורמים חוץ-כבדיים הנישאים על ידי הדם ועם שליטה מלאה על תנאי הניסוי. מספר שינויים נעשו כדי לשפר את מודל זילוח כבד חולדה במהלך השנים10,11,12,13. למרות שעכברים שימשו למחקרי כבד מחוררים מבודדים, פחות ספרות זמינה. כאן, אנו מציגים שיטה לזילוח באתרו של כבד העכבר על ידי קנולציה של הווריד הפורטלי והווריד הנבוב העל-כבד נחות כדי לחקור את התגובות המטבוליות החריפות והישירות למצעים מטבוליים ולהורמונים כפי שנמדדו בשפכים הורידיים של הכבד מכבד העכבר בזמן אמת.
Protocol
Representative Results
Discussion
כבד העכבר המבודד הוא כלי מחקר חזק לחקר הדינמיקה והמנגנונים המולקולריים של חילוף החומרים בכבד. האפשרות של איסוף דגימות מדקה לדקה מספקת הערכה מפורטת של ההשפעה הישירה של תרכובת בדיקה על הכבד. בהשוואה למחקרי in vivo, הכבד המחורר מאפשר לנו לחקור את חילוף החומרים בכבד באופן מבודד תוך הימנעות ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקרים וניקולאי ג’יי וור אלברכטסן נתמכו על ידי קרן נובו נורדיסק Excellence Emerging Investigator Grant – אנדוקרינולוגיה ומטבוליזם (Application No. NNF19OC0055001), פרס מנהיג העתיד של הקרן האירופית לחקר הסוכרת (NNF21SA0072746) וקרן המחקר העצמאית דנמרק, Sapere Aude (1052-00003B). מרכז נובו נורדיסק לחקר חלבונים נתמך כספית על ידי קרן נובו נורדיסק (הסכם מענק NNF14CC0001). איור 1B נוצר באמצעות biorender.com. אנו מודים לד”ר רונה א. קוהר (Novo Nordisk A/S) על דיונים פוריים על כבד עכבר מחורר.
References
- Bale, S. S., Geerts, S., Jindal, R., Yarmush, M. L. Isolation and co-culture of rat parenchymal and non-parenchymal liver cells to evaluate cellular interactions and response. Scientific Reports. 6, 25329 (2016).
- Lauschke, V. M., et al. Massive rearrangements of cellular MicroRNA signatures are key drivers of hepatocyte dedifferentiation. Hepatology. 64 (5), 1743-1756 (2016).
- Seirup, M., et al. Rapid changes in chromatin structure during dedifferentiation of primary hepatocytes in vitro. Genomics. 114 (3), 110330 (2022).
- Gupta, R., et al. Comparing in vitro human liver models to in vivo human liver using RNA-Seq. Archive of Toxicology. 95 (2), 573-589 (2021).
- Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function, and disease. Scientific Reports. 6, 25187 (2016).
- Dewyse, L., Reynaert, H., van Grunsven, L. A. Best practices and progress in precision-cut liver slice cultures. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 7137 (2021).
- Li, X., George, S. M., Vernetti, L., Gough, A. H., Taylor, D. L. A glass-based, continuously zonated and vascularized human liver acinus microphysiological system (vLAMPS) designed for experimental modeling of diseases and ADME/TOX. Lab on a Chip. 18 (17), 2614-2631 (2018).
- Broutier, L., et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocols. 11 (9), 1724-1743 (2016).
- Bartošek, I., Guaitani, A., Miller, L. L. . Isolated Liver Perfusion and its Applications. , (1973).
- Gores, G. J., Kost, L. J., LaRusso, N. F. The isolated perfused rat liver: conceptual and practical considerations. Hepatology. 6 (3), 511-517 (1986).
- Mischinger, H. J., et al. An improved technique for isolated perfusion of rat livers and an evaluation of perfusates. Journal of Surgical Research. 53 (2), 158-165 (1992).
- Vairetti, M., et al. Correlation between the liver temperature employed during machine perfusion and reperfusion damage: role of Ca2. Liver Transplantation. 14 (4), 494-503 (2008).
- Ferrigno, A., Richelmi, P., Vairetti, M. Troubleshooting and improving the mouse and rat isolated perfused liver preparation. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 107-114 (2013).
- Zawada, R. J. X., Kwan, P., Olszewski, K. L., Llinas, M., Huang, S. -. G. Quantitative determination of urea concentrations in cell culture medium. Biochemistry and Cell Biology. 87 (3), 541-544 (2009).
