В данной работе мы представляем надежный метод перфузии печени мышей in situ для изучения острой и прямой регуляции метаболизма печени без нарушения печеночной архитектуры, но при отсутствии внепеченочных факторов.
Печень выполняет множество функций, включая метаболизм питательных веществ. В отличие от других моделей исследования печени in vitro и in vivo , изолированная перфузионная печень позволяет изучать биологию и метаболизм печени в целом печени с интактной печеночной архитектурой, отделенной от влияния внепеченочных факторов. Перфузии печени были первоначально разработаны для крыс, но метод был адаптирован и к мышам. Здесь мы опишем протокол перфузии печени мыши in situ . Печень перфузируется антеградно через воротную вену оксигенированным бикарбонатным буфером Кребса-Хензелейта, а выход собирается из надпеченочной нижней полой вены с пережатием подпеченочной нижней полой вены для замыкания контура. С помощью этого метода можно оценить прямое воздействие исследуемого соединения на печень с подробным временным разрешением. Функция и жизнеспособность печени стабильны в течение, по крайней мере, 3 ч, что позволяет включить внутренний контроль в тот же эксперимент. Экспериментальные возможности с использованием этой модели многочисленны и могут помочь понять физиологию печени и ее заболевания.
Печень является важным органом в обмене веществ. Он играет ключевую роль в контроле энергетического баланса всего организма, регулируя метаболизм глюкозы, липидов и аминокислот. Рост числа заболеваний печени во всем мире становится серьезным глобальным бременем для здравоохранения, и необходимо больше знаний о патофизиологии и ее последствиях для функций печени.
Для исследований печени были разработаны различные модели in vitro, дополняющие исследования in vivo. Широко используются выделенные и культивируемые первичные гепатоциты грызунов и человека. Непаренхиматозные клетки могут быть отделены от гепатоцитов с помощью дифференциального и градиентного центрифугирования, а совместное культивирование различных типов клеток полезно для изучения межклеточных перекрестных помех1. Несмотря на то, что первичные гепатоциты человека считаются золотым стандартом для тестирования токсичности лекарств, несколько исследований показали, что гепатоциты быстро дедифференцируются в культуре тканей, что приводит к потере функций печени 2,3,4. Культивирование гепатоцитов в 3D-сфероидной системе улучшает дифференцировку, более стабильно и, по-видимому, имитирует печень in vivo в большей степени, чем традиционные 2D-системы культивирования. Точно вырезанные срезы печени являются еще одной хорошо зарекомендовавшей себя моделью in vitro, которая сохраняет тканевую архитектуру нетронутой и содержит непаренхиматозные клетки, присутствующие в печени6. К более продвинутым моделям in vitro относятся печень на чипе7 и органоиды печени8. Однако при всех этих подходах происходит потеря структурной целостности и динамики потока, в том числе векторного потока в портально-печеночных венах, что, вероятно, влияет на обобщаемость.
Изолированная перфузионная печень крысы была впервые описана Клодом Бернаром в 1855 году и до сих пор используется в различных научных областях для изучения биологии, токсикологии и патофизиологии печени. Преимущества перфузии печени по сравнению с вышеупомянутыми моделями in vitro включают сохранение печеночной архитектуры, сосудистого потока, полярности и зональности гепатоцитов, а также взаимодействия между гепатоцитами и непаренхиматозными клетками. По сравнению с исследованиями in vivo, перфузионная печень позволяет изучать метаболизм печени изолированно, избегая внепеченочных факторов, переносимых кровью, и с полным контролем над условиями эксперимента. В течение10,11,12,13 лет было сделано несколько модификаций для улучшения модели перфузии печени крыс. Несмотря на то, что для изолированных исследований перфузионной печени использовались мыши, литературы по ним меньше. В данной работе мы представляем метод перфузии печени мышей in situ путем канюляции воротной вены и надпеченочной полой вены для изучения острых и прямых метаболических реакций на метаболические субстраты и гормоны, измеренных в печеночном венозном стоке из печени мыши в режиме реального времени.
Изолированная перфузионная печень мыши является мощным исследовательским инструментом для изучения динамики и молекулярных механизмов печеночного метаболизма. Возможность поминутного отбора проб обеспечивает детальную оценку непосредственного воздействия исследуемого соединен?…
The authors have nothing to disclose.
Исследования и Nicolai J. Wewer Albrechtsen были поддержаны грантом Novo Nordisk Foundation Excellence Emerging Investigator Grant – Endocrinology and Metabolism (Application No. NNF19OC0055001), премия Европейского фонда по изучению диабета (NNF21SA0072746) и Независимого исследовательского фонда Дании, Sapere Aude (1052-00003B). Центр исследований белка Фонда Ново Нордиск получает финансовую поддержку Фонда Ново Нордиск (Грантовое соглашение NNF14CC0001). Рисунок 1B был создан с помощью biorender.com. Мы благодарим д-ра Руне Е. Куре (Novo Nordisk A/S) за плодотворные дискуссии о перфузионной печени мышей.