Hepatik Glikoz Üretimi, Ürejenez ve Lipoliz, Perfüze Fare Karaciğer Modeli Kullanılarak Ölçüldü
Summary
Burada, karaciğer mimarisini bozmadan, ancak karaciğer dışı faktörlerin yokluğunda karaciğer metabolizmasının akut ve doğrudan regülasyonunu incelemek için fare karaciğerinin yerinde perfüzyonu için sağlam bir yöntem sunuyoruz.
Abstract
Karaciğer, besin metabolizması da dahil olmak üzere çok sayıda fonksiyona sahiptir. Diğer in vitro ve in vivo karaciğer araştırma modellerinin aksine, izole edilmiş perfüze karaciğer, karaciğer biyolojisi ve metabolizmasının, karaciğer dışı faktörlerin etkisinden ayrılmış, bozulmamış bir hepatik mimari ile tüm karaciğerde incelenmesine izin verir. Karaciğer perfüzyonları başlangıçta sıçanlar için geliştirilmiştir, ancak yöntem farelere de uyarlanmıştır. Burada fare karaciğerinin in situ perfüzyonu için bir protokol tarif ediyoruz. Karaciğer, oksijenli Krebs-Henseleit bikarbonat tamponu ile portal venden antegrad olarak perfüze edilir ve çıktı, devreyi kapatmak için infrahepatik inferior vena kavanın klemplenmesi ile suprahepatik inferior vena kavadan toplanır. Bu yöntem kullanılarak, bir test bileşiğinin doğrudan hepatik etkileri, ayrıntılı bir zaman çözünürlüğü ile değerlendirilebilir. Karaciğer fonksiyonu ve canlılığı en az 3 saat boyunca stabildir ve aynı deneye iç kontrollerin dahil edilmesine izin verir. Bu modeli kullanan deneysel olasılıklar çoktur ve karaciğer fizyolojisi ve karaciğer hastalıkları hakkında fikir verebilir.
Introduction
Karaciğer metabolizmada önemli bir organdır. Glikoz, lipid ve amino asit metabolizmasını düzenleyerek tüm vücut enerji dengesinin kontrolünde anahtar rol oynar. Dünya çapında karaciğer hastalıklarındaki artış, önemli bir küresel sağlık yükü olarak ortaya çıkmaktadır ve patofizyoloji ve karaciğer fonksiyonları üzerindeki sonuçları hakkında daha fazla bilgiye ihtiyaç vardır.
İn vivo çalışmaları tamamlamak için karaciğer araştırmaları için çeşitli in vitro modeller geliştirilmiştir. Kemirgenlerden ve insanlardan izole edilmiş ve kültürlenmiş primer hepatositler yaygın olarak kullanılmaktadır. Parankimal olmayan hücreler, diferansiyel ve gradyan santrifüjleme kullanılarak hepatositlerden ayrılabilir ve farklı hücre tiplerinin ko-kültürü, hücreler arası karışma1’i incelemek için yararlıdır. Primer insan hepatositleri, ilaç toksisitesini test etmek için altın standart olarak kabul edilse de, birkaç çalışma, hepatositlerin doku kültüründe hızla farklılaştığını ve bunun sonucunda hepatik fonksiyonların kaybına neden olduğunu göstermiştir 2,3,4. 3D sferoid sistemdeki hepatosit kültürü, farklılaşmayı iyileştirir, daha kararlıdır ve karaciğeri in vivo olarak geleneksel 2D kültür sistemlerinden daha yüksek derecede taklit ediyor gibi görünmektedir5. Hassas kesilmiş karaciğer dilimleri, doku mimarisini sağlam tutan ve karaciğerde bulunan parankimal olmayan hücreleri içeren bir başka köklü in vitro modeldir6. Daha gelişmiş in vitro modeller arasında çip üzerinde karaciğer7 ve karaciğer organoidleri8 bulunur. Bununla birlikte, tüm bu yaklaşımlarla, vektörel portal-hepatik ven akışı da dahil olmak üzere yapısal bütünlük ve akış dinamiklerinde bir kayıp vardır ve bu da genellenebilirliği büyük olasılıkla etkiler.
İzole perfüze sıçan karaciğeri ilk olarak 1855’te Claude Bernard tarafındantanımlanmıştır 9 ve hala karaciğer biyolojisi, toksikoloji ve patofizyoloji çalışmaları için çeşitli bilimsel alanlarda kullanılmaktadır. Perfüze karaciğerin yukarıda belirtilen in vitro modellere göre avantajları arasında hepatik mimarinin korunması, vasküler akış, hepatosit polaritesi ve zonlaması ve hepatositler ile parankimal olmayan hücreler arasındaki etkileşimler yer alır. İn vivo çalışmalarla karşılaştırıldığında, perfüze karaciğer, kan tarafından taşınan karaciğer dışı faktörlerden kaçınarak ve deneysel koşullar üzerinde tam kontrol ile karaciğer metabolizmasının izole bir şekilde incelenmesine izin verir. 10,11,12,13 yıllarında sıçan karaciğer perfüzyon modelini geliştirmek için çeşitli değişiklikler yapılmıştır. İzole perfüze karaciğer çalışmaları için fareler kullanılmış olsa da, daha az literatür mevcuttur. Burada, fare karaciğerinden gelen hepatik venöz atık suda gerçek zamanlı olarak ölçülen metabolik substratlara ve hormonlara akut ve doğrudan metabolik yanıtları incelemek için portal ven ve suprahepatik vena kava inferiorunun kanülasyonu ile fare karaciğerinin in situ perfüzyonu için bir yöntem sunuyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
İzole perfüze fare karaciğeri, hepatik metabolizmanın dinamikleri ve moleküler mekanizmaları üzerine yapılan çalışmalar için güçlü bir araştırma aracıdır. Dakikadan dakikaya numune toplama imkanı, bir test bileşiğinin karaciğer üzerindeki doğrudan etkisinin ayrıntılı bir değerlendirmesini sağlar. İn vivo çalışmalarla karşılaştırıldığında, perfüze karaciğer, kan tarafından taşınan karaciğer dışı faktörlerden kaçınarak ve deneysel koşullar üzerinde tam kontro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Çalışmalar ve Nicolai J. Wewer Albrechtsen, Novo Nordisk Vakfı Mükemmeliyet Gelişmekte Olan Araştırmacı Hibe – Endokrinoloji ve Metabolizma (Başvuru No. NNF19OC0055001), Avrupa Diyabet Araştırmaları Vakfı Geleceğin Lideri Ödülü (NNF21SA0072746) ve Danimarka Bağımsız Araştırma Fonu, Sapere Aude (1052-00003B). Novo Nordisk Vakfı Protein Araştırmaları Merkezi, Novo Nordisk Vakfı tarafından finansal olarak desteklenmektedir (Hibe sözleşmesi NNF14CC0001). Şekil 1B, biorender.com ile oluşturulmuştur. Dr. Rune E. Kuhre’ye (Novo Nordisk A/S) perfüze fare karaciğeri ile ilgili verimli görüşmeler için teşekkür ederiz.
References
- Bale, S. S., Geerts, S., Jindal, R., Yarmush, M. L. Isolation and co-culture of rat parenchymal and non-parenchymal liver cells to evaluate cellular interactions and response. Scientific Reports. 6, 25329 (2016).
- Lauschke, V. M., et al. Massive rearrangements of cellular MicroRNA signatures are key drivers of hepatocyte dedifferentiation. Hepatology. 64 (5), 1743-1756 (2016).
- Seirup, M., et al. Rapid changes in chromatin structure during dedifferentiation of primary hepatocytes in vitro. Genomics. 114 (3), 110330 (2022).
- Gupta, R., et al. Comparing in vitro human liver models to in vivo human liver using RNA-Seq. Archive of Toxicology. 95 (2), 573-589 (2021).
- Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function, and disease. Scientific Reports. 6, 25187 (2016).
- Dewyse, L., Reynaert, H., van Grunsven, L. A. Best practices and progress in precision-cut liver slice cultures. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 7137 (2021).
- Li, X., George, S. M., Vernetti, L., Gough, A. H., Taylor, D. L. A glass-based, continuously zonated and vascularized human liver acinus microphysiological system (vLAMPS) designed for experimental modeling of diseases and ADME/TOX. Lab on a Chip. 18 (17), 2614-2631 (2018).
- Broutier, L., et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocols. 11 (9), 1724-1743 (2016).
- Bartošek, I., Guaitani, A., Miller, L. L. . Isolated Liver Perfusion and its Applications. , (1973).
- Gores, G. J., Kost, L. J., LaRusso, N. F. The isolated perfused rat liver: conceptual and practical considerations. Hepatology. 6 (3), 511-517 (1986).
- Mischinger, H. J., et al. An improved technique for isolated perfusion of rat livers and an evaluation of perfusates. Journal of Surgical Research. 53 (2), 158-165 (1992).
- Vairetti, M., et al. Correlation between the liver temperature employed during machine perfusion and reperfusion damage: role of Ca2. Liver Transplantation. 14 (4), 494-503 (2008).
- Ferrigno, A., Richelmi, P., Vairetti, M. Troubleshooting and improving the mouse and rat isolated perfused liver preparation. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 107-114 (2013).
- Zawada, R. J. X., Kwan, P., Olszewski, K. L., Llinas, M., Huang, S. -. G. Quantitative determination of urea concentrations in cell culture medium. Biochemistry and Cell Biology. 87 (3), 541-544 (2009).
