Summary

Profilierung der Bakteriengemeinschaft von gärenden Traminette-Trauben während der Weinproduktion mittels metagenomischer Amplikon-Sequenzierung

Published: December 01, 2023
doi:

Summary

Hier stellen wir ein Protokoll zur Beschreibung der Amplikon-Metagenomik zur Bestimmung der Bakteriengemeinschaft von Traminette-Trauben, gärenden Trauben und Endwein vor.

Abstract

Fortschritte in der Sequenzierungstechnologie und der relativ einfache Zugang zur Verwendung von Bioinformatik-Tools zur Profilierung mikrobieller Gemeinschaftsstrukturen haben ein besseres Verständnis sowohl kultivierbarer als auch nicht kultivierbarer Mikroben in Trauben und Wein ermöglicht. Während der industriellen Fermentation sind bekannte und unbekannte Mikroben oft für die Produktentwicklung und den Fehlgeschmack verantwortlich. Daher kann die Profilierung der Bakterien von der Traube bis zum Wein ein einfaches Verständnis der mikrobiellen Dynamik in situ ermöglichen. In dieser Studie wurden die Bakterien des Gärungsmostes der Traminette-Trauben und der endgültige Wein einer DNA-Extraktion unterzogen, die 15 ng/μl bis 87 ng/μl ergab. Das 16S-Amplikon der hypervariablen Region der V4-Region wurde sequenziert, relativ häufige Bakterien, bestehend aus den Stämmen Proteobacteria, Actinobacteriota, Firmicutes, Bacteroidota, Fusobacteriota und gefolgt von der Verrucomicrobiota, Halobacterota, Desulfobacterota, Myxococcota und Acidobacteriota. Eine Venn-Diagramm-Analyse der gemeinsamen einzigartigen operativen taxonomischen Einheiten (OTU) ergab, dass 15 Bakterienstämme sowohl dem Traubenmost, der Gärphase als auch dem endgültigen Wein gemeinsam waren. Phyla, die zuvor nicht berichtet wurden, wurden mit der 16S-Amplikon-Sequenzierung nachgewiesen, ebenso wie Gattungen wie Enterobacteriaceae und Lactobacillaceae. Variationen in der Verwendung organischer Nährstoffe in Wein und ihre Auswirkungen auf Bakterien wurden getestet; Traminette R-Tank mit Fermaid O und Traminette L , stimuliert mit Stimula Sauvignon blanc + Fermaid O. Die Alpha-Diversität mit Hilfe des Kruskal-Wallis-Tests bestimmte den Grad der Gleichmäßigkeit. Die Beta-Diversität deutete auf eine Verschiebung der Bakterien in der Gärungsphase für die beiden Behandlungen hin, und die endgültigen Weinbakterien sahen ähnlich aus. Die Studie bestätigte, dass die 16S-Amplikon-Sequenzierung zur Überwachung von Bakterienveränderungen während der Weinproduktion verwendet werden kann, um die Qualität und bessere Nutzung von Traubenbakterien während der Weinproduktion zu unterstützen.

Introduction

Die Traminette-Traube zeichnet sich durch eine Produktion von höchster Weinqualität aus, zusätzlich zu einem beträchtlichen Ertrag und einer teilweisen Resistenz gegen verschiedene Pilzinfektionen 1,2,3. Die natürliche Gärung von Trauben hängt von assoziierten Mikroorganismen, der Weinproduktionsumgebung und den Gärgefäßenab 4,5. Oft verlassen sich viele Weingüter auf wilde Hefen und Bakterien für die Gärung, die Produktion von Alkohol, Estern, Aroma und Geschmacksentwicklung6.

Ziel dieser Studie ist es, die bakterielle Zusammensetzung von Trauben zu untersuchen und ihre Dynamik während der Gärung zu überwachen. Die moderne Verwendung von Starterkulturen wie Saccharomyces cerevisiae für die Primärgärung, bei der Alkohol produziert wird, ist jedoch bei verschiedenen Weinstilen üblich7. Darüber hinaus verbessert die Nachgärung, bei der Apfelsäure von Oenococcus oeni zu Milchsäure decarboxyliert wird, das organoleptische und Geschmacksprofil des Weins und reduziert den Säuregehalt des Weins 8,9. Mit den jüngsten Fortschritten bei der Verwendung kulturunabhängiger Methoden ist es nun möglich, verschiedene Mikroben zu bestimmen, die mit der Keltertraube assoziiert sind, und die Arten, die in den Most überführt werden und zu unterschiedlichen Zeitpunkten bis zum Endprodukt an der Gärung teilnehmen10.

Die Rolle und Dynamik von Wildbakterien aus verschiedenen Trauben, die während der Weingärung auf den Most übertragen werden, sind kaum verstanden. Die Taxonomie vieler dieser Bakterien ist nicht einmal bekannt, oder ihre phänotypischen Eigenschaften sind nicht charakterisiert. Dadurch wird ihre Anwendung in der Kokulturfermentation noch wenig genutzt. Mikrobiologische kulturbasierte Analysen wurden jedoch verwendet, um die Bakterienpopulation zu bestimmen, die mit Trauben und Wein assoziiert ist10. Es ist allgemein bekannt, dass die selektive Kulturbeschichtung langwierig und anfällig für Verunreinigungen ist, eine geringe Reproduzierbarkeit aufweist und die Ergebnisse zweifelhaft sein können. Es fehlen auch Bakterienarten, deren Wachstumsanforderungen unbekannt sind. Frühere Studien deuten darauf hin, dass kulturunabhängige, auf 16S-rRNA-Genen basierende Methoden einen zuverlässigeren und kostengünstigeren Ansatz zur Charakterisierung komplexer mikrobieller Gemeinschaften bieten11. Beispielsweise wurde die Sequenzierung der hypervariablen Regionen des 16S rRNA-Gens erfolgreich eingesetzt, um Bakterien in Weinblättern, Beeren und Wein zu untersuchen 12,13,14. Studien haben gezeigt, dass die Verwendung von 16S rRNA-Metabarcoding oder ganzer metagenomischer Sequenzierung für Mikrobiomstudien geeignet ist15. Es gibt neue Informationen über den möglichen Zusammenhang der bakteriellen Vielfalt mit ihren metabolischen Eigenschaften während der Weinproduktion, die bei der Bestimmung der önologischen Eigenschaften und des Terroirs helfen könnten16.

Die Notwendigkeit, die Vorteile der metagenomischen Werkzeuge durch Next-Generation-Sequencing (NGS) zur Untersuchung der mikrobiellen Ökologie von Trauben und Wein zu maximieren, wurde betont16,17. Auch der Einsatz kulturunabhängiger Methoden auf der Grundlage der Hochdurchsatzsequenzierung zur Profilierung der mikrobiellen Vielfalt des Lebensmittel- und Fermentationsökosystems ist für viele Labore sehr relevant und wertvoll geworden und wird für den industriellen Einsatz empfohlen18,19. Es bietet einen Vorteil bei der Erkennung und taxonomischen Profilierung der vorhandenen mikrobiellen Populationen und des Beitrags von Umweltmikroben, ihrer relativen Häufigkeit und der Alpha- und Beta-Diversität20. Die Sequenzierung der variablen Region der 16S-Region ist zu einem wichtigen Gen der Wahl geworden und wurde in verschiedenen mikrobiellen ökologischen Studien verwendet.

Während sich viele Studien auf Pilze, insbesondere Hefen, während der Weingärung konzentrieren21, berichtete diese Studie über die 16S-Amplikon-Sequenzierung und bioinformatische Werkzeuge, die zur Untersuchung der Bakterien während der Gärung von Traminette-Trauben für die Weinproduktion verwendet werden.

Protocol

1. Experimentelle Weinproduktion Beziehen Sie Traminnette-Trauben von Dynamis Estate-Wein im Weinberg Jonesville, North Carolina, entrappen und zerkleinern, um den Most in zwei separate offene 600-Liter-Gärbehälter zu geben und etwa 4 Tage lang mit aufgesetzten Deckeln auf den Schalen zu belassen. Schlagen Sie die Kappen einmal täglich nach unten, um die Haut feucht zu halten und die Produktion flüchtiger Säuren (VA) zu begrenzen.HINWEIS: Die Idee ist, dass sich viele der aro…

Representative Results

Die Menge und Qualität der DNA, die aus Traubenmost, gärendem Wein und Endwein extrahiert wurde, wurden zunächst bestimmt; der Mengenwert reicht von 15-87 ng/μL (Tabelle 1). Sequenzierung und BioinformatikDer Illumina-Hochdurchsatz-Sequenzer erzeugte eine FASTQ-Datei, die in den Nephele importiert und auf der QIIME 2-Plattform26 angezeigt wurde. Zunächst wurde die FastQC-Software verwendet, um die Sequenzqualit…

Discussion

Das Protokoll der Metagenomik beginnt mit der Probenahme des Traubenmostes, und wenn dem Most Hefe zugesetzt wurde, dem gärenden Wein und der endgültigen Weinprobe. Es folgte eine doppelte DNA-Extraktion, die erfolgreich aus diesen Proben extrahiert wurde. Die erhaltenen Mengen variierten in der Konzentration von 15 ng/μl bis 87 ng/μl. Dies zeigt, dass das DNA-Extraktionsprotokoll für metagenomische Studien von Wein wirksam ist. Obwohl die Qualität der DNA bei A260/A280 variiert, kann dies auf verschiedene Paramete…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Finanzierung durch das Stipendium des Appalachian State University Research Council (URC) und das CAPES Print Travel-Stipendium, das den Besuch der FAO an der Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto – São Paulo, Brasilien, unterstützte, werden dankbar gewürdigt. Diese Studie wurde teilweise von der Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Finanzcode 001 finanziert. Das ECPDM ist dankbar für das CAPES Print Travel Stipendium, das ihren Besuch an der Appalachian State University unterstützte. Das ECPDM ist Research Fellow 2 des Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, Brasilien (CNPq).

Materials

Agarose gel  Promega, Madison, WI USA V3121 Electrophoresis 
FastPrep DNA spinKit for soil  MP Biomedicals, Solon, OH USA 116560-200 DNA extraction 
FastQC software Babraham Institute, United Kingdom Bioinformatics 
Fermaid O Scott Laboratory, Petaluma, CA USA  Fermentation 
High-Fidelity PCR Master Mix  New England Biolabs, USA F630S Polymerase chain reaction for sequencing 
NEBNext Ultra New England Biolabs, USA NEB #E7103 DNA Library Prep
NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit  Illumina, San Diego, CA  USA DNA sequencing 
NovaSeq Control Software (NVCS) Illumina, San Diego, CA  USA DNA sequencing 
Novaseq6000 platform  Illumina, San Diego, CA  USA DNA sequencing 
QuiBit Thermoscientific, Waltham, MA, USA DNA quantification 
Quickdrop spectrophotometer  Molecular device, San Jose, CA, USA DNA quantification 
Sodium Phosphate  Sigma Aldrich 342483 DNA extraction buffer
Stimula Sauvignon Blanc Scott Laboratory, Petaluma, CA USA  Fermentation 

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Goppold, A., Conradie, L., Almeida, O. G. G. d., De Martinis, E. C. P., Oguntoyinbo, F. A. Profiling the Bacterial Community of Fermenting Traminette Grapes during Wine Production using Metagenomic Amplicon Sequencing. J. Vis. Exp. (202), e65598, doi:10.3791/65598 (2023).

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