Summary

Modèle microfluidique d’entérocolite nécrosante incorporant des entéroïdes intestinaux néonatals humains et un microbiome dysbiotique

Published: July 28, 2023
doi:

Summary

Ce protocole décrit un modèle in vitro d’entérocolite nécrosante (NEC), qui peut être utilisé pour des études mécanistiques de la pathogenèse de la maladie. Il est doté d’une puce microfluidique ensemencée d’entéroïdes intestinaux dérivés de l’intestin néonatal humain, de cellules endothéliales et du microbiome intestinal d’un nouveau-né atteint d’une NEC sévère.

Abstract

L’entérocolite nécrosante (ECN) est une maladie intestinale grave et potentiellement mortelle qui a été difficile à étudier en raison de sa pathogenèse complexe, qui reste incomplètement comprise. La physiopathologie de la NEC comprend la perturbation des jonctions serrées intestinales, l’augmentation de la perméabilité de la barrière intestinale, la mort des cellules épithéliales, la dysbiose microbienne et l’inflammation déréglée. Les outils traditionnels pour étudier la NEC comprennent des modèles animaux, des lignées cellulaires et des organoïdes intestinaux humains ou murins. Bien que les études utilisant ces systèmes modèles aient amélioré la compréhension de la physiopathologie de la maladie, leur capacité à récapituler la complexité de la NEC humaine est limitée. Un modèle in vitro amélioré de NEC utilisant la technologie microfluidique, appelé NEC-on-a-chip, a maintenant été développé. Le modèle NEC-on-a-chip consiste en un dispositif microfluidique ensemencé avec des entéroïdes intestinaux dérivés d’un nouveau-né prématuré, co-cultivé avec des cellules endothéliales humaines et le microbiome d’un nourrisson atteint d’une NEC sévère. Ce modèle est un outil précieux pour les études mécanistiques sur la physiopathologie de la NEC et une nouvelle ressource pour les tests de découverte de médicaments pour les maladies intestinales néonatales. Dans ce manuscrit, une description détaillée du modèle NEC-on-a-chip sera fournie.

Introduction

L’entérocolite nécrosante (ECN) touche les prématurés, avec une incidence allant jusqu’à 10 % chez ceux nés pesant < 1500 g1. La physiopathologie de la NEC est complexe et comprend des lésions de l’épithélium intestinal, une perturbation des jonctions intestinales serrées, une augmentation de la perméabilité de la barrière intestinale, un dérèglement immunitaire et la mort des cellules épithéliales 2,3. Notre compréhension des mécanismes impliqués dans la pathogenèse de la NEC reste incomplète et, malgré des décennies de recherche, il n’existe toujours pas de thérapies ciblées efficaces.

L’un des principaux obstacles à l’avancement de la recherche sur la NEC est la disponibilité limitée et la petite taille des tissus intestinaux primaires isolés chez les nourrissons humains. Les tissus intestinaux réséqués chez les nourrissons atteints d’ECN sont souvent nécrotiques et gravement endommagés, ce qui complique les études sur les mécanismes qui précèdent l’apparition de la maladie. Par exemple, l’intestin grêle des nourrissons atteints d’ECN est inondé de cellules immunitaires, et un nombre réduit de cellules souches intestinales, une diminution de la prolifération des cellules épithéliales et une augmentation de l’apoptose des cellules épithéliales sont également observés 4,5,6,7. Cela entraîne des difficultés à cultiver les cellules épithéliales intestinales à partir de ces échantillons et à isoler l’ARN et les protéines, qui peuvent être dégradés dans cet environnement inflammatoire hostile. De plus, étant donné que le processus de la maladie est déjà avancé chez les nourrissons atteints d’une NEC chirurgicale, les études mécanistiques sur les facteurs qui induisent la maladie sont impossibles. Ces limitations ont conduit à une dépendance à l’égard de modèles animaux pour les études mécanistiques de la NEC.

Des modèles animaux de NEC ont été établis pour les souris, les rats, les porcelets, les lapins et les babouins 5,8,9,11. L’un des points forts des modèles animaux est que la maladie intestinale de type NEC est induite par des facteurs associés à l’apparition de NEC chez l’homme, notamment un microbiome dysbiotique, des épisodes répétés d’hypoxie et l’absence d’allaitement au lait maternel 5,8,10,11. De plus, la réponse inflammatoire et les changements pathologiques observés au cours de la NEC expérimentale sont parallèles à la maladie humaine 5,9,12. Bien que ces modèles imitent de nombreuses caractéristiques de la NEC humaine, il existe des différences inhérentes entre la physiopathologie de la NEC chez les animaux et les humains. Par exemple, le modèle murin de NEC est induit chez des souris nées à terme, et bien que leur développement intestinal soit incomplet, la physiopathologie de NEC est intrinsèquement différente dans ce contexte clinique. L’expression des gènes intestinaux murins à la naissance est similaire à celle d’un fœtus humain préviable et ne se rapproche pas de celle d’un nouveau-né prématuré de 22 à 24 semaines de gestation jusqu’au jour 14 (P14)13. Cela confond le modèle NEC murin parce que les lésions intestinales ne peuvent généralement pas être induites chez les souris après P10. De plus, les souches consanguines de souris n’ont pas la diversité immunologique14 et microbiologique des nouveau-nés humains15, ce qui constitue un autre facteur de confusion. Ainsi, l’incorporation accrue d’échantillons humains primaires dans la recherche NEC améliore la pertinence clinique des études dans ce domaine.

Les études sur les mécanismes de la NEC in vitro ont traditionnellement utilisé des lignées cellulaires monotypiques dérivées de cellules cancéreuses intestinales adultes, telles que les cellules d’adénocarcinome colorectal (Caco2) et d’adénocarcinome du côlon humain (HT-29)16. Ces modèles sont pratiques, mais limités en pertinence physiologique en raison de leur croissance à partir de cellules cancéreuses adultes, de leur architecture non polarisée et des changements phénotypiques liés à des passages répétés en culture. Les entéroïdes intestinaux améliorent ces modèles puisqu’ils peuvent être cultivés à partir des cryptes du tissu intestinal, différenciés en tous les sous-types épithéliaux intestinaux et former une structure tridimensionnelle (3D) semblable à des villosités17,18,19,20. Récemment, les entéroïdes intestinaux ont été combinés à la technologie microfluidique pour développer un modèle d’intestin grêle sur puce et fournir un système modèle in vitro plus pertinent sur le plan physiologique21.

Les premiers dispositifs microfluidiques d’organes sur puce ont été introduits au début des années2000 22,23,24. Le premier modèle d’organe sur puce était le poumon sur puce à respiration humaine25. Il a été suivi par de nombreux modèles mono-organes tels que l’intestin 21, le foie 26, les reins 27, la moelle osseuse 28, la barrière hémato-encéphalique 29 et le cœur30. Ces modèles d’organes sur puce ont été utilisés pour étudier les maladies aiguës, chroniques et rares, notamment le syndrome d’irradiation aiguë31, la bronchopneumopathie chronique obstructive32 et les maladies neurodégénératives33. La nature polarisée des cellules sur ces puces et la présence de deux compartiments cellulaires séparés par une membrane poreuse permettent de modéliser des processus physiologiques complexes tels que la perfusion, les gradients de concentration chimique et la chimiotaxie des cellules immunitaires34,35. Ces systèmes microfluidiques constituent ainsi un nouvel outil pour l’étude de la physiopathologie et des mécanismes des maladies humaines.

Le modèle de l’intestin grêle sur puce a été décrit par Kasendra et al. en 2018, qui ont utilisé des échantillons de biopsie de l’intestin grêle pédiatriques (âgés de 10 à 14 ans) différenciés en entéroïdes et cultivés sur un dispositif microfluidique21. Les cellules endothéliales vasculaires, l’écoulement continu des milieux et l’étirement/relaxation ont également été incorporés dans ce modèle. Ils ont observé la différenciation des sous-types épithéliaux intestinaux, la formation d’axes 3D en forme de villosités, la production de mucus et les modèles d’expression des gènes de l’intestin grêle21. Ce modèle microfluidique a été appliqué aux maladies néonatales avec le développement du système NEC-on-a-chip, qui intègre les entéroïdes intestinaux néonatals, les cellules endothéliales et le microbiome d’un nouveau-né atteint de NEC36. La NEC sur puce récapitule de nombreuses caractéristiques essentielles de la NEC humaine, notamment l’expression des gènes inflammatoires, la perte de cellules épithéliales spécialisées et la réduction de la fonction de barrière intestinale36. Ainsi, ce modèle a de nombreuses applications dans l’étude de la NEC, y compris les études mécanistiques et la découverte de médicaments. Dans ce manuscrit, un protocole détaillé pour les performances du modèle NEC-on-a-chip est fourni.

Protocol

Les entéroïdes ont été obtenus à partir d’échantillons de l’intestin grêle de nourrissons prématurés (nés entre 22 et 36 semaines de gestation) obtenus au moment de la chirurgie pour une NEC ou d’autres affections intestinales d’étiologies non inflammatoires. Tous les prélèvements et traitements d’échantillons ont été effectués après le consentement éclairé et l’approbation des comités d’examen institutionnels de l’Université Washington à St. Louis (numéros de protocole 201706182 e…

Representative Results

Des entéroïdes ont été ensemencés sur le dispositif microfluidique (Figure 1) et mis en culture comme décrit ci-dessus. La croissance des entéroïdes dans l’hydrogel de la matrice de culture cellulaire avant l’ensemencement, puis l’expansion subséquente de la monocouche de cellules épithéliales intestinales après l’ensemencement du dispositif ont été surveillées par microscopie à fond clair (Figure 2). Une monocouche de cellules épithéli…

Discussion

Ce système NEC-on-a-chip est un nouvel outil puissant qui peut être utilisé pour modéliser la physiopathologie de la NEC. Cette plate-forme fournit un microenvironnement complexe qui ressemble plus étroitement au milieu intestinal in vivo que les modèles précédents en incorporant un système de co-culture avec un flux luminal continu et un étirement. Ces conditions favorisent le développement d’une architecture 3D en forme de villosités tapissée d’un épithélium hautement polarisé constitué de…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce manuscrit a été soutenu par R01DK118568 (MG), R01DK124614 (MG) et R01HD105301 (MG) des National Institutes of Health, la subvention de l’initiative Chan Zuckerberg 2022-316749 (MG), une bourse de début de carrière (LCF) du Thrasher Research Fund, une subvention de chercheur en début de carrière (LCF) de l’UNC Children’s Development grâce au généreux soutien de donateurs de l’Université de Caroline du Nord à Chapel Hill, et le département de pédiatrie de l’Université de Caroline du Nord à Chapel Hill.

Materials

[Leu15]-Gastrin I human Sigma-Aldrich G9145
A 83-01 Sigma-Aldrich SML0788
Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Gibco 12634010
B-27 Supplement, serum free (50x) Gibco 17504044
Basic Bio-kit Emulate N/A
BioTek Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader Agilent  7131000
BRAND Methacrylate (PMMA) Cuvettes, Semi-Micro BrandTech 759085D
Cell Recovery Solution Corning 354270
CFX Opus Real-Time PCR Systems Bio-Rad 12011319
Chip Cradle Emulate N/A
Chip-S1 Stretchable Chip Emulate N/A
CHIR99021 Sigma-Aldrich SML1046
Clear TC-treated Multiple Well Plates,  48 well  Corning 3548
Collagen from human placenta Sigma-Aldrich C5533
Collagenase, Type I, powder Gibco 17018029
Complete Human Endothelial Cell Medium with Kit  Cell Biologics H-1168
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 15 mL Fisher Scientific 05-539-12
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 50mL Fisher Scientific 05-539-8
Countess Cell Counting Chamber Slides Invitrogen  C10283
Countess II automated cell counter Invitrogen  AMQAX1000
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) Invitrogen D3571
DAPT Sigma-Aldrich D5942
Dextran, Cascade Blue, 3000 MW, Anionic, Lysine Fixable Invitrogen  D7132 Permeability dye 
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
Disposable PES Filter Units, 0.2um aPES membrane Fisher Scientific FB12566504
DMEM/F-12 Gibco 11320033
Donkey serum Sigma-Aldrich D9663
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium – high glucose Sigma-Aldrich D5796
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (DPBS) Gibco 14190-136
EDTA, 0.5 M,  pH 8.0 Corning 46-034-CI
ER-1 surface activation reagent Emulate ER-1 Chip Activation Reagent 1
ER-2 surface activation reagent  Emulate ER-2 Chip Activation Reagent 2
Fibronectin Human Protein, Plasma Gibco 33016015
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid, 100mm Fisher Scientific FB0875713
Gelatin-Based Coating Solution  Cell Biologics 6950
Genie Temp-Shaker 300 Scientific Industries, Inc. SI-G300
Gentamicin  Gibco 15750060
HEPES, Liquid 1M Solution (238.3 mg/ mL) Corning 25-060-CI
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate  Invitrogen H3570
Human Collagen Type I Sigma-Aldrich CC050
Human Primary Small Intestinal Microvascular Endothelial Cells Cell Biologics H-6054
Inverted Microscope Fisher Scientific 03-000-013
Isotemp General Purpose Deluxe Water Baths Fisher Scientific FSGPD10
L-Glutamine  Gibco 25030-081
Luria Broth (LB) agar, Miller Supelco L3027
L-WRN Cells  American Type Culture Collection CRL-3276
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, LDEV-free  Corning 356231 Cell Culture Matrix
N-2 Supplement (100x) Gibco 17502048
N-acetyl-L-cysteine Sigma-Aldrich 1009005
NAILSTAR UV LAMP NailStar NS-01-US
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer Thermo Scientific 840-274200
Nicotinamide Sigma-Aldrich 72340
Orb-HM1 Hub Module Emulate N/A
Paraformaldehyde ThermoFisher 047392.9L
Penicillin-Streptomycin  Gibco 15140122
Phosphate buffered saline (PBS) Gibco 10010023
Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+ Rainin 17013805
Pipette Tips TR LTS 1000µL S 768A/8 Rainin 17014966
Pod Portable Module Emulate N/A
Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS)(Heat Inactivated)  Avantor Seradigm 1500-500
QuantiTect Reverse Transcription Kit  QIAGEN 205313
Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF) PeproTech 315-09
SB 431542 Tocris 1614
Square BioAssay Dish with Handles, not TC-treated  Corning 431111
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 1725271
Steriflip-GV Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit Millipore SE1M179M6
Sterile Cell Strainers, 70um Fisher Scientific 22-363-548
Sterile Syringes, 10mL Fisher Scientific 14-955-453
Straight, fine, sharp point scissors Miltex Instruments MH5-300
Thermo Scientific Sorvall X4R Pro-MD Centrifuge Thermo Scientific 75016052
Triton X-100  Sigma-Aldrich T8787 Detergent
TRIzol Reagent  Invitrogen 15596026 RNA extraction reagent
Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) in PBS, pH 7.5 ± 0.5 Corning 25-900-CI
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red  Gibco 12604013 Enzymatic Dissociation Reagent
Trypsin-EDTA solution Sigma-Aldrich T4174
VIOS 160i CO2 Incubator, 165 L Thermo Scientific 13-998-252
Y-27632 Tocris 1254
Zoë-CM1 Culture Module Emulate N/A

References

  1. Alsaied, A., Islam, N., Thalib, L. Global incidence of Necrotizing Enterocolitis: a systematic review and Meta-analysis. BMC Pediatrics. 20 (1), 344 (2020).
  2. Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. The New England Journal of Medicine. 364 (3), 255-264 (2011).
  3. Frazer, L. C., Good, M. Intestinal epithelium in early life. Mucosal Immunology. 15 (6), 1181-1187 (2022).
  4. Good, M., et al. The human milk oligosaccharide 2′-fucosyllactose attenuates the severity of experimental necrotising enterocolitis by enhancing mesenteric perfusion in the neonatal intestine. The British Journal of Nutrition. 116 (7), 1175-1187 (2016).
  5. Mihi, B., Lanik, W. E., Gong, Q., Good, M. A Mouse Model of Necrotizing Enterocolitis. Methods in Molecular Biology. 2321, 101-110 (2021).
  6. Afrazi, A., et al. Toll-like receptor 4-mediated endoplasmic reticulum stress in intestinal crypts induces necrotizing enterocolitis. The Journal of Biological Chemistry. 289 (14), 9584-9599 (2014).
  7. Neal, M. D., et al. Toll-like receptor 4 is expressed on intestinal stem cells and regulates their proliferation and apoptosis via the p53 up-regulated modulator of apoptosis. The Journal of Biological Chemistry. 287 (44), 37296-37308 (2012).
  8. Sodhi, C., Richardson, W., Gribar, S., Hackam, D. J. The development of animal models for the study of necrotizing enterocolitis. Disease models & mechanisms. 1 (2-3), 94-98 (2008).
  9. Ares, G. J., McElroy, S. J., Hunter, C. J. The science and necessity of using animal models in the study of necrotizing enterocolitis. Seminars in pediatric surgery. 27 (1), 29-33 (2018).
  10. Lu, P., et al. Animal models of gastrointestinal and liver diseases. Animal models of necrotizing enterocolitis: pathophysiology, translational relevance, and challenges. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 306 (11), G917-G928 (2014).
  11. Nolan, L. S., Gong, Q., Hofmeister, H. N., Good, M. A protocol for the induction of experimental necrotizing enterocolitis in neonatal mice. STAR Protocol. 2 (4), 100951 (2021).
  12. Egan, C. E., et al. Toll-like receptor 4-mediated lymphocyte influx induces neonatal necrotizing enterocolitis. The Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 495-508 (2016).
  13. Stanford, A. H., et al. A direct comparison of mouse and human intestinal development using epithelial gene expression patterns. Pediatric Research. 88 (1), 66-76 (2020).
  14. Noll, K. E., Ferris, M. T., Heise, M. T. The Collaborative Cross: A Systems Genetics Resource for Studying Host-Pathogen Interactions. Cell Host Microbe. 25 (4), 484-498 (2019).
  15. Ericsson, A. C., Franklin, C. L. The gut microbiome of laboratory mice: considerations and best practices for translational research. Mammalian Genome. 32 (4), 239-250 (2021).
  16. De Fazio, L., et al. Necrotizing Enterocolitis: Overview on In Vitro Models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).
  17. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  18. Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1124-1134 (2014).
  19. Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
  20. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  21. Kasendra, M., et al. Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids. Scientific Reports. 8 (1), 2871 (2018).
  22. Middendorp, S., et al. Adult stem cells in the small intestine are intrinsically programmed with their location-specific function. Stem Cells. 32 (5), 1083-1091 (2014).
  23. Sung, J. H., Kam, C., Shuler, M. L. A microfluidic device for a pharmacokinetic-pharmacodynamic (PK-PD) model on a chip. Lab Chip. 10 (4), 446-455 (2010).
  24. Sung, J. H., Shuler, M. L. A micro cell culture analog (microCCA) with 3-D hydrogel culture of multiple cell lines to assess metabolism-dependent cytotoxicity of anti-cancer drugs. Lab Chip. 9 (10), 1385-1394 (2009).
  25. Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  26. Jang, K. J., et al. Reproducing human and cross-species drug toxicities using a Liver-Chip. Science translational medicine. 11 (517), eaax5516 (2019).
  27. Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature biomedical engineering. 1, 0069 (2017).
  28. Chou, D. B., et al. On-chip recapitulation of clinical bone marrow toxicities and patient-specific pathophysiology. Nature biomedical engineering. 4 (4), 394-406 (2020).
  29. Park, T. E., et al. Hypoxia-enhanced Blood-Brain Barrier Chip recapitulates human barrier function and shuttling of drugs and antibodies. Nature Communications. 10 (1), 2621 (2019).
  30. Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies. Lab Chip. 13 (18), 3599-3608 (2013).
  31. Jalili-Firoozinezhad, S., et al. Modeling radiation injury-induced cell death and countermeasure drug responses in a human Gut-on-a-Chip. Cell Death & Disease. 9 (2), 223 (2018).
  32. Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).
  33. Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. On-chip 3D neuromuscular model for drug screening and precision medicine in neuromuscular disease. Nature Protocols. 15 (2), 421-449 (2020).
  34. Chen, Y. C., et al. Single-cell Migration Chip for Chemotaxis-based Microfluidic Selection of Heterogeneous Cell Populations. Scientific Reports. 5, 9980 (2015).
  35. Xiang, Y., et al. Gut-on-chip: Recreating human intestine in vitro. Journal of tissue engineering. 11, 2041731420965318 (2020).
  36. Lanik, W. E., et al. Microfluidic device facilitates in vitro modeling of human neonatal necrotizing enterocolitis-on-a-chip. JCI Insight. 8 (8), e146496 (2023).
  37. Emulate. . Duodenum Intestine-Chip Protocol. , (2022).
  38. Good, M., et al. Lactobacillus rhamnosus HN001 decreases the severity of necrotizing enterocolitis in neonatal mice and preterm piglets: evidence in mice for a role of TLR9 . American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 306 (11), G1021-G1032 (2014).
  39. JoVE Science Education Database. Serial Dilutions and Plating: Microbial Enumeration. JoVE. , (2023).
  40. VanDussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. L-WRN conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams. Stem Cell Research. 37, 101430 (2019).
  41. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).

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Frazer, L. C., Yamaguchi, Y., Jania, C. M., Lanik, W. E., Gong, Q., Singh, D. K., Mackay, S., Akopyants, N. S., Good, M. Microfluidic Model of Necrotizing Enterocolitis Incorporating Human Neonatal Intestinal Enteroids and a Dysbiotic Microbiome. J. Vis. Exp. (197), e65605, doi:10.3791/65605 (2023).

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