Ce protocole décrit un modèle in vitro d’entérocolite nécrosante (NEC), qui peut être utilisé pour des études mécanistiques de la pathogenèse de la maladie. Il est doté d’une puce microfluidique ensemencée d’entéroïdes intestinaux dérivés de l’intestin néonatal humain, de cellules endothéliales et du microbiome intestinal d’un nouveau-né atteint d’une NEC sévère.
L’entérocolite nécrosante (ECN) est une maladie intestinale grave et potentiellement mortelle qui a été difficile à étudier en raison de sa pathogenèse complexe, qui reste incomplètement comprise. La physiopathologie de la NEC comprend la perturbation des jonctions serrées intestinales, l’augmentation de la perméabilité de la barrière intestinale, la mort des cellules épithéliales, la dysbiose microbienne et l’inflammation déréglée. Les outils traditionnels pour étudier la NEC comprennent des modèles animaux, des lignées cellulaires et des organoïdes intestinaux humains ou murins. Bien que les études utilisant ces systèmes modèles aient amélioré la compréhension de la physiopathologie de la maladie, leur capacité à récapituler la complexité de la NEC humaine est limitée. Un modèle in vitro amélioré de NEC utilisant la technologie microfluidique, appelé NEC-on-a-chip, a maintenant été développé. Le modèle NEC-on-a-chip consiste en un dispositif microfluidique ensemencé avec des entéroïdes intestinaux dérivés d’un nouveau-né prématuré, co-cultivé avec des cellules endothéliales humaines et le microbiome d’un nourrisson atteint d’une NEC sévère. Ce modèle est un outil précieux pour les études mécanistiques sur la physiopathologie de la NEC et une nouvelle ressource pour les tests de découverte de médicaments pour les maladies intestinales néonatales. Dans ce manuscrit, une description détaillée du modèle NEC-on-a-chip sera fournie.
L’entérocolite nécrosante (ECN) touche les prématurés, avec une incidence allant jusqu’à 10 % chez ceux nés pesant < 1500 g1. La physiopathologie de la NEC est complexe et comprend des lésions de l’épithélium intestinal, une perturbation des jonctions intestinales serrées, une augmentation de la perméabilité de la barrière intestinale, un dérèglement immunitaire et la mort des cellules épithéliales 2,3. Notre compréhension des mécanismes impliqués dans la pathogenèse de la NEC reste incomplète et, malgré des décennies de recherche, il n’existe toujours pas de thérapies ciblées efficaces.
L’un des principaux obstacles à l’avancement de la recherche sur la NEC est la disponibilité limitée et la petite taille des tissus intestinaux primaires isolés chez les nourrissons humains. Les tissus intestinaux réséqués chez les nourrissons atteints d’ECN sont souvent nécrotiques et gravement endommagés, ce qui complique les études sur les mécanismes qui précèdent l’apparition de la maladie. Par exemple, l’intestin grêle des nourrissons atteints d’ECN est inondé de cellules immunitaires, et un nombre réduit de cellules souches intestinales, une diminution de la prolifération des cellules épithéliales et une augmentation de l’apoptose des cellules épithéliales sont également observés 4,5,6,7. Cela entraîne des difficultés à cultiver les cellules épithéliales intestinales à partir de ces échantillons et à isoler l’ARN et les protéines, qui peuvent être dégradés dans cet environnement inflammatoire hostile. De plus, étant donné que le processus de la maladie est déjà avancé chez les nourrissons atteints d’une NEC chirurgicale, les études mécanistiques sur les facteurs qui induisent la maladie sont impossibles. Ces limitations ont conduit à une dépendance à l’égard de modèles animaux pour les études mécanistiques de la NEC.
Des modèles animaux de NEC ont été établis pour les souris, les rats, les porcelets, les lapins et les babouins 5,8,9,11. L’un des points forts des modèles animaux est que la maladie intestinale de type NEC est induite par des facteurs associés à l’apparition de NEC chez l’homme, notamment un microbiome dysbiotique, des épisodes répétés d’hypoxie et l’absence d’allaitement au lait maternel 5,8,10,11. De plus, la réponse inflammatoire et les changements pathologiques observés au cours de la NEC expérimentale sont parallèles à la maladie humaine 5,9,12. Bien que ces modèles imitent de nombreuses caractéristiques de la NEC humaine, il existe des différences inhérentes entre la physiopathologie de la NEC chez les animaux et les humains. Par exemple, le modèle murin de NEC est induit chez des souris nées à terme, et bien que leur développement intestinal soit incomplet, la physiopathologie de NEC est intrinsèquement différente dans ce contexte clinique. L’expression des gènes intestinaux murins à la naissance est similaire à celle d’un fœtus humain préviable et ne se rapproche pas de celle d’un nouveau-né prématuré de 22 à 24 semaines de gestation jusqu’au jour 14 (P14)13. Cela confond le modèle NEC murin parce que les lésions intestinales ne peuvent généralement pas être induites chez les souris après P10. De plus, les souches consanguines de souris n’ont pas la diversité immunologique14 et microbiologique des nouveau-nés humains15, ce qui constitue un autre facteur de confusion. Ainsi, l’incorporation accrue d’échantillons humains primaires dans la recherche NEC améliore la pertinence clinique des études dans ce domaine.
Les études sur les mécanismes de la NEC in vitro ont traditionnellement utilisé des lignées cellulaires monotypiques dérivées de cellules cancéreuses intestinales adultes, telles que les cellules d’adénocarcinome colorectal (Caco2) et d’adénocarcinome du côlon humain (HT-29)16. Ces modèles sont pratiques, mais limités en pertinence physiologique en raison de leur croissance à partir de cellules cancéreuses adultes, de leur architecture non polarisée et des changements phénotypiques liés à des passages répétés en culture. Les entéroïdes intestinaux améliorent ces modèles puisqu’ils peuvent être cultivés à partir des cryptes du tissu intestinal, différenciés en tous les sous-types épithéliaux intestinaux et former une structure tridimensionnelle (3D) semblable à des villosités17,18,19,20. Récemment, les entéroïdes intestinaux ont été combinés à la technologie microfluidique pour développer un modèle d’intestin grêle sur puce et fournir un système modèle in vitro plus pertinent sur le plan physiologique21.
Les premiers dispositifs microfluidiques d’organes sur puce ont été introduits au début des années2000 22,23,24. Le premier modèle d’organe sur puce était le poumon sur puce à respiration humaine25. Il a été suivi par de nombreux modèles mono-organes tels que l’intestin 21, le foie 26, les reins 27, la moelle osseuse 28, la barrière hémato-encéphalique 29 et le cœur30. Ces modèles d’organes sur puce ont été utilisés pour étudier les maladies aiguës, chroniques et rares, notamment le syndrome d’irradiation aiguë31, la bronchopneumopathie chronique obstructive32 et les maladies neurodégénératives33. La nature polarisée des cellules sur ces puces et la présence de deux compartiments cellulaires séparés par une membrane poreuse permettent de modéliser des processus physiologiques complexes tels que la perfusion, les gradients de concentration chimique et la chimiotaxie des cellules immunitaires34,35. Ces systèmes microfluidiques constituent ainsi un nouvel outil pour l’étude de la physiopathologie et des mécanismes des maladies humaines.
Le modèle de l’intestin grêle sur puce a été décrit par Kasendra et al. en 2018, qui ont utilisé des échantillons de biopsie de l’intestin grêle pédiatriques (âgés de 10 à 14 ans) différenciés en entéroïdes et cultivés sur un dispositif microfluidique21. Les cellules endothéliales vasculaires, l’écoulement continu des milieux et l’étirement/relaxation ont également été incorporés dans ce modèle. Ils ont observé la différenciation des sous-types épithéliaux intestinaux, la formation d’axes 3D en forme de villosités, la production de mucus et les modèles d’expression des gènes de l’intestin grêle21. Ce modèle microfluidique a été appliqué aux maladies néonatales avec le développement du système NEC-on-a-chip, qui intègre les entéroïdes intestinaux néonatals, les cellules endothéliales et le microbiome d’un nouveau-né atteint de NEC36. La NEC sur puce récapitule de nombreuses caractéristiques essentielles de la NEC humaine, notamment l’expression des gènes inflammatoires, la perte de cellules épithéliales spécialisées et la réduction de la fonction de barrière intestinale36. Ainsi, ce modèle a de nombreuses applications dans l’étude de la NEC, y compris les études mécanistiques et la découverte de médicaments. Dans ce manuscrit, un protocole détaillé pour les performances du modèle NEC-on-a-chip est fourni.
Ce système NEC-on-a-chip est un nouvel outil puissant qui peut être utilisé pour modéliser la physiopathologie de la NEC. Cette plate-forme fournit un microenvironnement complexe qui ressemble plus étroitement au milieu intestinal in vivo que les modèles précédents en incorporant un système de co-culture avec un flux luminal continu et un étirement. Ces conditions favorisent le développement d’une architecture 3D en forme de villosités tapissée d’un épithélium hautement polarisé constitué de…
The authors have nothing to disclose.
Ce manuscrit a été soutenu par R01DK118568 (MG), R01DK124614 (MG) et R01HD105301 (MG) des National Institutes of Health, la subvention de l’initiative Chan Zuckerberg 2022-316749 (MG), une bourse de début de carrière (LCF) du Thrasher Research Fund, une subvention de chercheur en début de carrière (LCF) de l’UNC Children’s Development grâce au généreux soutien de donateurs de l’Université de Caroline du Nord à Chapel Hill, et le département de pédiatrie de l’Université de Caroline du Nord à Chapel Hill.
[Leu15]-Gastrin I human | Sigma-Aldrich | G9145 | |
A 83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 | Gibco | 12634010 | |
B-27 Supplement, serum free (50x) | Gibco | 17504044 | |
Basic Bio-kit | Emulate | N/A | |
BioTek Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader | Agilent | 7131000 | |
BRAND Methacrylate (PMMA) Cuvettes, Semi-Micro | BrandTech | 759085D | |
Cell Recovery Solution | Corning | 354270 | |
CFX Opus Real-Time PCR Systems | Bio-Rad | 12011319 | |
Chip Cradle | Emulate | N/A | |
Chip-S1 Stretchable Chip | Emulate | N/A | |
CHIR99021 | Sigma-Aldrich | SML1046 | |
Clear TC-treated Multiple Well Plates, 48 well | Corning | 3548 | |
Collagen from human placenta | Sigma-Aldrich | C5533 | |
Collagenase, Type I, powder | Gibco | 17018029 | |
Complete Human Endothelial Cell Medium with Kit | Cell Biologics | H-1168 | |
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 50mL | Fisher Scientific | 05-539-8 | |
Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10283 | |
Countess II automated cell counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | Invitrogen | D3571 | |
DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | |
Dextran, Cascade Blue, 3000 MW, Anionic, Lysine Fixable | Invitrogen | D7132 | Permeability dye |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
Disposable PES Filter Units, 0.2um aPES membrane | Fisher Scientific | FB12566504 | |
DMEM/F-12 | Gibco | 11320033 | |
Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium – high glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | |
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14190-136 | |
EDTA, 0.5 M, pH 8.0 | Corning | 46-034-CI | |
ER-1 surface activation reagent | Emulate | ER-1 | Chip Activation Reagent 1 |
ER-2 surface activation reagent | Emulate | ER-2 | Chip Activation Reagent 2 |
Fibronectin Human Protein, Plasma | Gibco | 33016015 | |
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid, 100mm | Fisher Scientific | FB0875713 | |
Gelatin-Based Coating Solution | Cell Biologics | 6950 | |
Genie Temp-Shaker 300 | Scientific Industries, Inc. | SI-G300 | |
Gentamicin | Gibco | 15750060 | |
HEPES, Liquid 1M Solution (238.3 mg/ mL) | Corning | 25-060-CI | |
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Invitrogen | H3570 | |
Human Collagen Type I | Sigma-Aldrich | CC050 | |
Human Primary Small Intestinal Microvascular Endothelial Cells | Cell Biologics | H-6054 | |
Inverted Microscope | Fisher Scientific | 03-000-013 | |
Isotemp General Purpose Deluxe Water Baths | Fisher Scientific | FSGPD10 | |
L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
Luria Broth (LB) agar, Miller | Supelco | L3027 | |
L-WRN Cells | American Type Culture Collection | CRL-3276 | |
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 356231 | Cell Culture Matrix |
N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502048 | |
N-acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | 1009005 | |
NAILSTAR UV LAMP | NailStar | NS-01-US | |
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | 840-274200 | |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | 72340 | |
Orb-HM1 Hub Module | Emulate | N/A | |
Paraformaldehyde | ThermoFisher | 047392.9L | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+ | Rainin | 17013805 | |
Pipette Tips TR LTS 1000µL S 768A/8 | Rainin | 17014966 | |
Pod Portable Module | Emulate | N/A | |
Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS)(Heat Inactivated) | Avantor Seradigm | 1500-500 | |
QuantiTect Reverse Transcription Kit | QIAGEN | 205313 | |
Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 315-09 | |
SB 431542 | Tocris | 1614 | |
Square BioAssay Dish with Handles, not TC-treated | Corning | 431111 | |
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725271 | |
Steriflip-GV Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit | Millipore | SE1M179M6 | |
Sterile Cell Strainers, 70um | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
Sterile Syringes, 10mL | Fisher Scientific | 14-955-453 | |
Straight, fine, sharp point scissors | Miltex Instruments | MH5-300 | |
Thermo Scientific Sorvall X4R Pro-MD Centrifuge | Thermo Scientific | 75016052 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Detergent |
TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | RNA extraction reagent |
Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) in PBS, pH 7.5 ± 0.5 | Corning | 25-900-CI | |
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red | Gibco | 12604013 | Enzymatic Dissociation Reagent |
Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4174 | |
VIOS 160i CO2 Incubator, 165 L | Thermo Scientific | 13-998-252 | |
Y-27632 | Tocris | 1254 | |
Zoë-CM1 Culture Module | Emulate | N/A |