Praktische overwegingen voor het ontwerp, de uitvoering en de interpretatie van studies met tests voor het buigen van hele botten van knaagdierbotten
Summary
Mechanisch testen van knaagdierbotten is een waardevolle methode om informatie te verkrijgen over de gevoeligheid van een bot voor breuken. Bij gebrek aan een goed praktisch begrip kunnen de resultaten te veel worden geïnterpreteerd of niet valide zijn. Dit protocol dient als leidraad om ervoor te zorgen dat mechanische tests nauwkeurig worden uitgevoerd om geldige en functionele gegevens te verkrijgen.
Abstract
Skeletfragiliteit die tot breuken leidt, is een Amerikaanse volksgezondheidscrisis die resulteert in 1.5 miljoen fracturen per jaar en $ 18 miljard aan directe zorgkosten. Het vermogen om de mechanismen te begrijpen die ten grondslag liggen aan botziekte en de respons op de behandeling is niet alleen gewenst, maar ook van cruciaal belang. Mechanisch testen van bot dient als een waardevolle techniek om de vatbaarheid van een bot voor breuken te begrijpen en te kwantificeren. Hoewel deze methode eenvoudig uit te voeren lijkt, kunnen er ongepaste en onnauwkeurige conclusies worden getrokken als de gebruiker de heersende aannames en belangrijke stappen buiten beschouwing laat. Dit is waargenomen in alle disciplines, aangezien studies nog steeds worden gepubliceerd met misbruik van methoden en onjuiste interpretatie van resultaten. Dit protocol zal dienen als inleiding voor de principes die verband houden met mechanisch testen, samen met de toepassing van deze technieken – van overwegingen van monstergrootte via weefseloogst en -opslag tot gegevensanalyse en interpretatie. Met dit in de hand kan waardevolle informatie worden verkregen over de vatbaarheid van een bot voor breuken, wat het begrip voor zowel academisch onderzoek als klinische oplossingen bevordert.
Introduction
Mechanisch testen van bot is de primaire methode om functionele informatie te extraheren met betrekking tot de gevoeligheid van een bot voor breuken. In preklinische studies kunnen verschillende testmodaliteiten worden gebruikt, maar verreweg de meest voorkomende is het buigen van lange botten. Deze tests zijn eenvoudig uit te voeren en kunnen worden gebruikt op botten variërend in grootte van mens tot muis. Aangezien muizen een van de meest bestudeerde dieren zijn in preklinisch onderzoek, zal dit protocol zich richten op buigtests die worden uitgevoerd op de femora en tibiae van muizen.
Voorafgaand aan het uitvoeren van buigtests moeten botten op de juiste manier worden geoogst en opgeslagen. De meest gebruikelijke opslagmethoden zijn van oudsher het invriezen van botten in met zoutoplossing doordrenkt gaas, het invriezen in alleen zoutoplossing of het uitdrogen van botten in ethanol 1. Van botten die in ethanol zijn opgeslagen, is aangetoond dat ze een verhoogde stijfheid en elasticiteitsmodulus hebben en lagere vervormingsparameters hebben dan botten die bevroren zijn opgeslagen1. Zelfs het rehydrateren van de botten voorafgaand aan het testen herstelt deze eigenschappen niet terug naar normale niveaus 1. Ondergedompeld in zoutoplossing kan schade aan het bot veroorzaken, omdat er druk wordt uitgeoefend als de zoutoplossing uitzet. Bovendien zou een volledige dooi van de oplossing nodig zijn om de botten te verwijderen voor microcomputertomografie (μCT) scanning. Bijgevolg is het invriezen van vers geoogste botten in met zoutoplossing gedrenkt gaas de standaard opslagmethode geworden en wordt dit in dit protocol aanbevolen.
Omdat de grootte en vorm van een bot van invloed zijn op de bulksterkte en veel ziektemodellen de botgrootte en morfologie aanzienlijk veranderen, worden technische principes gebruikt om de effecten van grootte weg te normaliseren om eigenschappen te produceren die het gedrag van het weefsel schatten. Deze aanpak vereist een dwarsdoorsnedegeometrie van de faallocatie, die meestal wordt verkregen met behulp van μCT om scans van de botten te maken voorafgaand aan het testen. μCT wordt veel gebruikt vanwege de beschikbaarheid en hoge beeldresolutie. Bovendien zijn bijdragen van zacht weefsel niet inbegrepen en vereist scannen geen chemische fixatie of andere aanpassingen aan het bot 3,4. Bij alle vormen van CT wordt een röntgenbron op een object gericht, terwijl een detector aan de andere kant van het object de resulterende röntgenenergie meet. Dit produceert een röntgenschaduw van het monster die kan worden omgezet in een beeld 3,5. Het object dat wordt gescand, wordt geroteerd (of de röntgenbron en detector worden rond het monster gedraaid), waardoor beelden worden gegenereerd die kunnen worden gereconstrueerd tot een driedimensionale dataset die het objectvertegenwoordigt 5.
De scanresolutie, of hoe dicht twee objecten bij elkaar kunnen liggen en toch afzonderlijk kunnen worden opgelost, wordt bepaald door de nominale voxelgrootte of de grootte van een pixel in de resulterende afbeelding te wijzigen. Het is algemeen aanvaard dat objecten ten minste twee keer zo groot moeten zijn als een enkele voxel om te worden geïdentificeerd3, maar een hogere verhouding zorgt voor een betere precisie. Verder zijn grotere voxels vatbaarder voor gedeeltelijke volume-effecten: wanneer een enkele voxel weefsels met verschillende dichtheden bevat, krijgt deze het gemiddelde van deze dichtheden toegewezen, in plaats van de specifieke dichtheid van een enkel weefsel, wat kan leiden tot een over- of onderschatting van weefselgebieden en mineraaldichtheid3. Hoewel deze problemen kunnen worden verholpen door kleinere voxelgroottes te kiezen, zorgt het gebruik van een hogere resolutie niet voor de eliminatie van gedeeltelijke volume-effecten en kan het een langere scantijd vereisen3. Bij het ex vivo scannen van botten wordt over het algemeen een voxelgrootte van 6-10 μm aanbevolen om de trabeculaire architectuur van muizenbotten nauwkeurig te beoordelen. Een grotere voxelgrootte van 10-17 μm kan worden gebruikt voor corticaal bot, hoewel de kleinste redelijke voxelgrootte moet worden gebruikt. Dit protocol maakt gebruik van een voxelgrootte van 10 μm, die klein genoeg is om belangrijke trabeculaire eigenschappen te onderscheiden en gedeeltelijke volume-effecten te minimaliseren zonder lange scantijd.
Röntgenenergie en energiefilterinstellingen moeten ook zorgvuldig worden gekozen, omdat de hoge mineraaldichtheid en dikte van botweefsel het uitgezonden röntgenenergiespectrum aanzienlijk verzwakt en verandert. Over het algemeen wordt aangenomen dat, omdat het uitgezonden röntgenspectrum gelijk is aan het spectrum dat het objectverlaat 6, het gebruik van laagenergetische röntgenstralen op dichte objecten zoals bot kan leiden tot een artefact dat bekend staat als bundelverharding7. Een hogere spanning van 50-70 kVp wordt aanbevolen bij het scannen van botmonsters om de incidentie van deze artefacten te verminderen5. Bovendien zorgt het plaatsen van een aluminium of koperen energiefilter voor een meer geconcentreerde energiestraal, waardoor artefacten verder worden geminimaliseerd 4,7. In dit protocol wordt een aluminium filter van 0,5 mm gebruikt.
Ten slotte bepalen de scanrotatiestap en de rotatielengte (bijv. 180°-360°) samen het aantal vastgelegde beelden, wat de hoeveelheid ruis in de uiteindelijke scanbepaalt 4. Het gemiddelde van meerdere frames in elke stap kan ruis verminderen, maar kan de scantijd verlengen4. Dit protocol maakt gebruik van een rotatiestap van 0,7 graden en een framegemiddelde van 2.
Nog een laatste opmerking over het scannen: hydroxyapatietkalibratiefantomen moeten worden gescand met dezelfde scaninstellingen als de experimentele botten om de omzetting van verzwakkingscoëfficiënten in mineraaldichtheid in g/cm mogelijk te maken35. Dit protocol maakt gebruik van fantomen van 0,25 g/cm3 en 0,75 g/cm3 hydroxyapatiet, hoewel er verschillende fantomen beschikbaar zijn. Houd er rekening mee dat sommige scansystemen interne fantomen gebruiken als onderdeel van de dagelijkse systeemkalibratie.
Zodra het scannen is voltooid, worden de hoekprojecties gereconstrueerd tot dwarsdoorsnedebeelden van het object, meestal met behulp van de bijbehorende software van de fabrikant. Welk systeem ook wordt gebruikt, het is belangrijk om ervoor te zorgen dat het hele bot in de reconstructie wordt vastgelegd en dat de drempelwaarde op de juiste manier wordt ingesteld om de herkenning van bot versus niet-bot mogelijk te maken. Na reconstructie is het van cruciaal belang om alle scans in drie dimensies te roteren, zodat de botten consistent worden georiënteerd en goed zijn uitgelijnd met de transversale as, opnieuw met behulp van de software van de fabrikant.
Na rotatie kunnen interessegebieden (ROI) voor analyse worden geselecteerd op basis van de vraag of corticale eigenschappen, trabeculaire eigenschappen of breukgeometrie voor mechanische normalisatie gewenst zijn. Voor het laatste moeten ROI’s na het testen worden geselecteerd door de afstand van de fractuurplaats tot het ene uiteinde van het bot te meten en de voxelgrootte te gebruiken om de overeenkomstige plaklocatie in het scanbestand te bepalen. Het geselecteerde gebied moet ten minste 100 μm lang zijn, met het breukpunt ongeveer in het midden van de ROI, om een adequate schatting te geven4.
Als ROI’s zijn geselecteerd, zijn er twee eigenschappen nodig voor mechanische normalisatie (om buigspanning en rek te berekenen): de maximale afstand van de neutrale buigas tot het oppervlak waar het falen wordt geïnitieerd (verondersteld het oppervlak te zijn dat onder spanning wordt belast, bepaald door de testopstelling), en het traagheidsmoment rond de neutrale as (ook afhankelijk van de testopstelling). Dit protocol beveelt het gebruik van een aangepaste code aan om deze waarden te bepalen. Neem voor toegang tot de code rechtstreeks contact op met de corresponderende auteur of bezoek de website van het lab op https://bbml.et.iupui.edu/ voor meer informatie.
Zodra de μCT-scan is voltooid, kan het mechanisch testen beginnen. Buigtests kunnen worden uitgevoerd in vierpunts- of driepuntsconfiguraties. Vierpuntsbuigtests hebben de voorkeur omdat ze de schuifspanning in het bot tussen de belastingspunten elimineren, waardoor in dit gebied pure buiging kan plaatsvinden3. Het bot zal dan breken als gevolg van spanning, waardoor een falen ontstaat dat meer representatief is voor de werkelijke buigeigenschappen van het bot3. Het bot moet echter zo worden belast dat het op beide laadpunten dezelfde belasting levert (dit kan worden vergemakkelijkt met een draaibare laadkop). Bij driepuntsbuigtests is er een grote verandering in schuifspanning waar het belastingspunt het bot raakt, waardoor het bot op dit punt breekt als gevolg van afschuiving, niet door spanning3. ASTM-normen bevelen aan dat materialen die worden gebogen, een lengte-breedteverhouding van 16:1 moeten hebben, wat betekent dat de lengte van de steunspanwijdte 16 keer groter moet zijn dan de breedte van het bot om de impact van afschuiving 8,9 te minimaliseren. Dit is vaak onmogelijk te bereiken bij het testen van kleine knaagdierbotten, dus de spanwijdte wordt eenvoudig zo groot mogelijk gemaakt, maar met een zo klein mogelijke verandering in de vorm van de dwarsdoorsnede. Bovendien moet bij het uitvoeren van vierpuntsbuiging de verhouding tussen de lengtes van de onderste en bovenste overspanning ~3:18 zijn, wat meestal kan worden bereikt in het scheenbeen, maar het is moeilijk in het kortere dijbeen. Bovendien maken de dunnere corticale wanden van dijbenen ze vatbaar voor vervorming van het ringtype, waardoor de vorm van de botdoorsnede tijdens de test verandert (dit kan worden geaccentueerd in vierpuntstests omdat er een grotere kracht nodig is om hetzelfde buigmoment te induceren in vergelijking met driepuntsbuiging). Daarom zal driepuntsbuiging worden gebruikt voor het dijbeen van muizen, terwijl vierpuntsbuiging zal worden gebruikt voor scheenbeenderen in dit protocol.
Ten slotte is het belangrijk om het onderzoek goed aan te sturen voor statistische analyse. Een algemene aanbeveling voor mechanisch testen is om een steekproefomvang van 10-12 botten per experimentele groep te hebben om verschillen te kunnen detecteren, aangezien sommige mechanische eigenschappen, met name parameters na de opbrengst, zeer variabel kunnen zijn. In sommige gevallen kan dit betekenen dat moet worden begonnen met een grotere steekproefomvang van dieren, gezien het verloop dat tijdens het onderzoek kan optreden. Analyse van de steekproefomvang met behulp van bestaande gegevens moet worden voltooid voordat een onderzoek wordt uitgevoerd.
Er zijn tal van beperkingen en aannames, maar buigtests kunnen vrij nauwkeurige resultaten opleveren, vooral wanneer relatieve verschillen tussen groepen van belang zijn. Deze eigenschappen, samen met de analyse van trabeculaire architectuur en corticale morfologie, kunnen een beter inzicht geven in ziektetoestanden en behandelingsregimes. Als we zorgvuldig omgaan met die aspecten van het experiment die we onder controle hebben (bijv. oogsten, opslaan, scannen en testen), kunnen we erop vertrouwen dat er nauwkeurige resultaten zijn gegenereerd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tijdens het scan- en testproces zijn er momenten waarop probleemoplossing en optimalisatie op hun plaats zijn. De eerste hiervan doet zich voor bij het scannen van botten met behulp van μCT. Hoewel veel systemen worden geleverd met een houder waarin één object kan worden vastgehouden en gescand, kunnen op maat gemaakte houders worden gemaakt om meerdere botten tegelijkertijd te scannen. Het scannen van meerdere botten kan een uitstekend punt voor optimalisatie zijn, maar voorzichtigheid is geboden tijdens het scan- en…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het werk dat is gedaan om dit protocol te ontwikkelen, is ondersteund door de National Institutes of Health [AR072609].
Materials
| CTAn | Bruker | NA | CT Scan Analysis Software |
| DataViewer | Bruker | NA | CT Scan Rotation Software |
| Matrix Laboratory (MATLAB) 2023a | MathWorks | NA | Coding platform used for data analysis |
| NRecon | Bruker | NA | CT Scan Reconstruction software |
| SKYSCAN 1272-100 kV w/ 16 MP CCD detector, incl 3D Suite Software | Micro Photonics Inc | SKY-016814 | Micro-CT system that can non-destructively visualize up to 209 mPs in every virtual slice through an object |
References
- Vesper, E. O., Hammond, M. A., Allen, M. R., Wallace, J. M. Even with rehydration, preservation in ethanol influences the mechanical properties of bone and how bone responds to experimental manipulation. Bone. 97, 49-53 (2017).
- Jepsen, K. J., Silva, M. J., Vashishth, D., Guo, X. E., van der Meulen, M. C. Establishing biomechanical mechanisms in mouse models: practical guidelines for systematically evaluating phenotypic changes in the diaphyses of long bones. Journal of Bone and Mineral Research. 30 (6), 951-966 (2015).
- Eds Burr, D. B., Allen, M. R. . Basic and Applied Bone Biology. , (2019).
- . . microCT SkyScan 1272 User Manual. , (2018).
- Kim, Y., Brodt, M. D., Tang, S. Y., Silva, M. J. MicroCT for scanning and analysis of mouse bones. Methods in Molecular Biology. 2230, 169-198 (2021).
- Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (7), 1468-1486 (2010).
- . . Micro-CT specimen scanner, Centre for high-throughput phenogenomics. , (2023).
- ASTM International. . Standard test method for flexural properties of unreinforced and reinforced plastics and electrical insulating materials by four-point bending. , (2020).
- ASTM International. . Standard test methods for flexural properties of unreinforced and reinforced plastics and electrical insulating materials. , (2017).
- . Bruker microCT NRecon: An overview. , (2023).
