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Biochemistry

"सिपुन्कुलस न्यूडस से फाइब्रिनोलिटिक एंजाइम का आत्मीयता शुद्धिकरण"।

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/65631

Summary

यहां, हम सिपुन्कुलस न्यूडस से एक फाइब्रिनोलिटिक एंजाइम की एक आत्मीयता शोधन विधि प्रस्तुत करते हैं जो सरल, सस्ती और कुशल है।

Abstract

सिपुन्कुलस न्यूडस (एसएफई) से फाइब्रिनोलिटिक एंजाइम एक नया फाइब्रिनोलिटिक एजेंट है जो प्लास्मिनोजेन को प्लास्मिन में सक्रिय कर सकता है और सीधे फाइब्रिन को नीचा दिखा सकता है, पारंपरिक थ्रोम्बोलाइटिक एजेंटों पर बहुत फायदे दिखा सकता है। हालांकि, संरचनात्मक जानकारी की कमी के कारण, एसएफई के लिए सभी शुद्धिकरण कार्यक्रम मल्टीस्टेप क्रोमैटोग्राफी शुद्धिकरण पर आधारित हैं, जो बहुत जटिल और महंगे हैं। यहां, एसएफई की क्रिस्टल संरचना के आधार पर पहली बार एसएफई का एक आत्मीयता शुद्धिकरण प्रोटोकॉल विकसित किया गया है; इसमें कच्चे नमूने की तैयारी और लाइसिन / आर्जिनिन-एगारोस मैट्रिक्स आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी कॉलम, आत्मीयता शुद्धि और शुद्ध एसएफई के लक्षण वर्णन शामिल हैं। इस प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, एसएफई के एक बैच को 1 दिन के भीतर शुद्ध किया जा सकता है। इसके अलावा, शुद्ध एसएफई की शुद्धता और गतिविधि क्रमशः 92% और 19,200 यू / एमएल तक बढ़ जाती है। इस प्रकार, यह एसएफई शुद्धिकरण के लिए एक सरल, सस्ती और कुशल दृष्टिकोण है। एसएफई और अन्य समान एजेंटों के आगे उपयोग के लिए इस प्रोटोकॉल का विकास बहुत महत्वपूर्ण है।

Introduction

थ्रोम्बोसिस सार्वजनिक स्वास्थ्य के लिए एक बड़ा खतरा है, खासकर कोविड -19 वैश्विक महामारी 1,2 के बाद। नैदानिक रूप से, कई प्लास्मिनोजेन एक्टिवेटर्स (पीए), जैसे ऊतक-प्रकार प्लास्मिनोजेन एक्टिवेटर (टीपीए) और यूरोकाइनेज (यूके), का व्यापक रूप से थ्रोम्बोलाइटिक दवाओं के रूप में उपयोग किया जाता है। पीए फाइब्रिन को नीचा दिखाने के लिए रोगियों के प्लास्मिनोजेन को सक्रिय प्लास्मिन में सक्रिय कर सकते हैं। इस प्रकार, उनकी थ्रोम्बोलाइटिक दक्षता रोगियों की प्लास्मिनोजेन स्थिति 3,4 द्वारा भारी प्रतिबंधित है। फाइब्रिनोलिटिक एजेंट, जैसे कि मेटालोप्रोटीनेज प्लास्मिन और सेरीन प्लास्मिन, एक अन्य प्रकार की नैदानिक थ्रोम्बोलाइटिक दवा है जिसमें प्लास्मिन जैसे फाइब्रिनोलिटिक एंजाइम (एफई) भी शामिल हैं, जो सीधे थक्के को भंग कर सकते हैं लेकिन विभिन्न प्लास्मिनअवरोधकों द्वारा जल्दी से निष्क्रिय हो जाते हैं। इसके बाद, एक नए प्रकार के फाइब्रिनोलिटिक एजेंट की सूचना दी गई है जो न केवल प्लास्मिनोजेन को प्लास्मिन में सक्रिय करके थ्रोम्बस को भंग कर सकता है, बल्कि फाइब्रिन को सीधे 6-प्राचीन मूंगफली के कीड़े सिपुन्कुलस न्यूडस (एसएफई) 6 से फाइब्रिनोलिटिक एंजाइम को भी कम कर सकता है। यह द्विफलन एसएफई को पारंपरिक थ्रोम्बोलाइटिक दवाओं पर अन्य फायदे प्रदान करता है, खासकर असामान्य प्लास्मिनोजेन स्थिति के संदर्भ में। अन्य द्विक्रियाशील फाइब्रिनोलिटिक एजेंटों 7,8,9 की तुलना में, एसएफई दवा के विकास के लिए गैर-खाद्य व्युत्पन्न एजेंटों पर सुरक्षा सहित कई फायदे प्रदर्शित करता है, खासकर मौखिक दवाओं के लिए। ऐसा इसलिए है क्योंकि सिपुन्कुलस न्यूडस की जैव सुरक्षा और जैव-रासायनिकता अच्छी तरहसे स्थापित की गई है।

सूक्ष्मजीवों, केंचुओं और मशरूम से अलग अन्य प्राकृतिक फाइब्रिनोलिटिक एजेंटों के समान, एस नुडस से एसएफई का शुद्धिकरण बहुत जटिल है और इसमें कई चरण शामिल हैं, जैसे ऊतक समरूपीकरण, अमोनियम सल्फेट वर्षा, विलवणीकरण, आयन-विनिमय क्रोमैटोग्राफी, हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन क्रोमैटोग्राफी, और आणविक चोरी10,11,12।. इस तरह की शुद्धि प्रणाली न केवल कुशल कौशल और महंगी सामग्री पर निर्भर करती है, बल्कि पूरी प्रक्रिया को पूरा करने के लिए कई दिनों की भी आवश्यकता होती है। इसलिए, एसएफई के आगे के विकास के लिए एसएफई का एक सरल शुद्धिकरण कार्यक्रम बहुत महत्वपूर्ण है। सौभाग्य से, एसएफई के दो क्रिस्टल (पीडीबी: 8एचजेडपी; PDB: 8HZO) सफलतापूर्वक प्राप्त किया गया है (पूरक फ़ाइल 1 और पूरक फ़ाइल 2 देखें)। संरचनात्मक विश्लेषण और आणविक डॉकिंग प्रयोगों के माध्यम से, हमने पाया कि एसएफई का उत्प्रेरक कोर विशेष रूप से आर्गिनिन या लाइसिन अवशेषों वाले लक्ष्यों से जुड़ सकता है।

इसमें, एसएफई की क्रिस्टल संरचना के आधार पर पहली बार एक आत्मीयता शुद्धिकरण प्रणाली प्रस्तावित की गई थी। इस प्रोटोकॉल का पालन करके, अत्यधिक शुद्ध और अत्यधिक सक्रिय एसएफई को एक ही आत्मीयता शुद्धिकरण चरण में कच्चे अर्क से शुद्ध किया जा सकता है। यहां विकसित प्रोटोकॉल न केवल एसएफई की बड़े पैमाने पर तैयारी के लिए महत्वपूर्ण है, बल्कि अन्य फाइब्रिनोलिटिक एजेंटों के शुद्धिकरण के लिए भी लागू किया जा सकता है।

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Protocol

1. तैयारी

  1. नमूना उपचार
    1. ताजा एस नुडस (100 ग्राम) को सावधानीपूर्वक विच्छेदित करें और आंत और उसके आंतरिक तरल पदार्थ को इकट्ठा करें।
    2. समरूपीकरण (1,000 आरपीएम, 60 एस) के लिए ट्रिस-एचसीएल बफर (0.02 एम, पीएच 7.4) के 300 एमएल जोड़ें।
    3. होमोजेनेट 3x को फ्रीज-पिघलाएं।
    4. नमूना (10,956 × ग्राम, 0.5 घंटे, 4 डिग्री सेल्सियस) को सेंट्रीफ्यूज करें और सतह पर तैरनेवाला एकत्र करें। आगे के उपयोग तक नमूने को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. प्रोटीन वर्षा
    1. सतह पर तैरनेवाला को संतृप्त अमोनियम सल्फेट समाधान (नौ वॉल्यूम) के साथ मिलाएं और मिश्रण को 4 डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटे तक खड़े रहने दें।
      नोट: प्रोटोकॉल को यहां रोका जा सकता है और बाद में जारी रखा जा सकता है।
    2. प्रोटीन अवक्षेप प्राप्त करने के लिए सेंट्रीफ्यूज (10,956 × ग्राम, 0.5 घंटे, 4 डिग्री सेल्सियस); बाद में उपयोग के लिए इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. प्रोटीन रिसस्पेंशन
    1. 30 मिलीलीटर ट्रिस-एचसीएल बफर (0.02 एम, पीएच 7.4) के साथ प्रोटीन अवक्षेप को पुन: निलंबित करें। बाद में उपयोग के लिए इस कच्चे प्रोटीन समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. एफिनिटी क्रोमैटोग्राफी

  1. Solution filtration
    1. कच्चे प्रोटीन समाधान को 0.22 μm फ़िल्टर झिल्ली के माध्यम से फ़िल्टर करें। बाद में उपयोग के लिए इस नमूने को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. स्तंभ पैकिंग
    1. आर्जिनिन-अगारोस मैट्रिक्स एफिनिटी क्रोमैटोग्राफी कॉलम और लाइसिन-एगारोस मैट्रिक्स एफिनिटी क्रोमैटोग्राफी कॉलम को 5 एमएल खाली क्रोमैटोग्राफी कॉलम में लाइसिन-अगारोस मैट्रिक्स माध्यम और आर्जिनिन-एग्रोस मैट्रिक्स माध्यम की उचित मात्रा लोड करके पैक करें।
      नोट: कॉलम को 2-8 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है, जिसमें मैट्रिक्स स्टोर बफर (20% इथेनॉल) में डूबा हुआ है।
  3. आत्मीयता शुद्धि
    1. पहले डीडीएच2ओ (1 एमएल / मिनट, 10 कॉलम वॉल्यूम) के साथ आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी कॉलम को समतुल्य करें, इसके बाद ट्रिस-एचसीएल बफर (0.02 एम, पीएच 8.0, 1 एमएल / मिनट, 5 कॉलम वॉल्यूम) के साथ।
    2. प्रोटीन समाधान नमूना पूर्व-समतुल्य कॉलम (1 एमएल / मिनट, 1/3 कॉलम वॉल्यूम) पर लोड करें।
      नोट: नमूना लोडिंग की मात्रा एसएफई की एकाग्रता पर निर्भर है।
    3. कॉलम को ट्रिस-एचसीएल बफर (0.02 एम, पीएच 8.0, पांच कॉलम वॉल्यूम) के साथ धोएं।
    4. स्तंभ को क्रमिक रूप से 0.15 मीटर, 0.25 मीटर, 0.35 मीटर, 0.45 मीटर, 0.55 मीटर और 0.65 मीटर एनएसीएल (1 एमएल / मिनट, पांच कॉलम वॉल्यूम) के साथ विभाजित करें।
    5. क्षालन शिखर की तलाश करें जो 0.15 M NaCl क्षालन में दिखाई देनी चाहिए, और फिर अंशों को 5 mL ट्यूबों में एकत्र करें।
    6. 3 केडी अल्ट्रा केन्द्रापसारक फिल्टर (3,944 × ग्राम, 1.5 घंटे, 4 डिग्री सेल्सियस) का उपयोग करके क्षालन नमूने को केंद्रित करें। बाद में उपयोग के लिए इस नमूने को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

3. शुद्धता मूल्यांकन

  1. सोडियम डोडेसिल-सल्फेट पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस-पेज) जेल तैयारी
    1. 5% केंद्रित जेल और 12% पृथक्करण जेल13 का उपयोग करके लेम्ली की विधि के अनुसार एसडीएस-पेज जेल तैयार करें।
  2. वैद्युतकणसंचलन
    1. नमूना (15 μL) को 5x SDS-PAGE प्रोटीन लोडिंग बफर (1/4 मात्रा) के साथ मिलाएं, 5 मिनट के लिए उबलते पानी में गर्म करें, SDS-PAGE जेल पर लोड करें, और 1.5 घंटे के लिए 80 V, 60 mA पर जेल चलाएं।
  3. विश्लेषण
    1. वैद्युतकणसंचलन के बाद, निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार, सिल्वर स्टेन किट के साथ जेल को दाग दें, और केमिल्यूमिनेसेंट इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके दाग वाले जेल का निरीक्षण करें।
    2. निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके लक्ष्य प्रोटीन की शुद्धता का विश्लेषण करें: लक्ष्य प्रोटीन की शुद्धता = लक्ष्य प्रोटीन की तीव्रता मूल्य / कुल प्रोटीन का तीव्रता मूल्य।

4. फाइब्रिनोलिटिक गतिविधि मूल्यांकन

  1. फाइब्रिन प्लेट की तैयारी
    1. 25 मिलीग्राम फाइब्रिनोजेन को 1.25 एमएल फिजियोलॉजिकल सेलाइन के साथ मिलाकर फाइब्रिनोजेन घोल तैयार करें।
    2. 1.05 एमएल शारीरिक लवण के साथ 100 यू थ्रोम्बिन को पूरी तरह से मिलाकर थ्रोम्बिन समाधान तैयार करें।
    3. ट्रिस-एचसीएल बफर (0.02 मोल / एल, पीएच 7.4) के 22.5 एमएल में 0.5 ग्राम एगारोस जोड़कर एगारोस समाधान तैयार करें। पूरी तरह से घुलने तक 100 डिग्री सेल्सियस पर अगारोस घोल को मिलाएं और गर्म करें।
    4. अगारोस घोल को लगभग 50 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें और फाइब्रिनोजेन समाधान जोड़ें। फिर, तुरंत थ्रोम्बिन समाधान जोड़ें, उन्हें जल्दी से मिलाएं, और उन्हें 60 मिमी कल्चर डिश में डालें।
  2. लोड
    1. एक बाँझ बोरर का उपयोग करके तैयार फाइब्रिन प्लेटों पर 3 मिमी कुओं को पंच करें और कुओं को 10 μL नमूनों से भरें।
  3. विश्लेषण
    1. 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन के 18 घंटे के बाद, उनके अपमानजनक क्षेत्रों के आकार की गणना करके फाइब्रिनोलिटिक गतिविधि को मापें। फाइब्रिनोलिटिक गतिविधि = (नमूने का क्षेत्र आकार / यूरोकाइनेज का क्षेत्र आकार) x 100 U. ज़ोन आकार = व्यास x व्यास।
      नोट: फिजियोलॉजिकल सेलाइन बफर, क्रूड प्रोटीन (प्रोटोकॉल चरण 1.3.1 में प्राप्त नमूना), और यूरोकाइनेज का उपयोग क्रमशः रिक्त, नकारात्मक नियंत्रण और सकारात्मक नियंत्रण के लिए किया गया था। यूरोकाइनेज की तुलना में, हमने पाया कि शुद्ध एसएफई की फाइब्रिनोलिटिक गतिविधि ~ 19,200 यू / एमएल थी।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल के बाद, कच्चे ऊतक लाइसेट निकाले गए, आर्जिनिन-अगारोस मैट्रिक्स और लाइसिन-एगारोस मैट्रिक्स एफिनिटी क्रोमैटोग्राफी कॉलम बनाए गए, शुद्ध एसएफई प्राप्त किया गया, और शुद्ध एसएफई की शुद्धता और फाइब्रिनोलिटिक गतिविधि को क्रमशः एसडीएस-पेज और फाइब्रिन प्लेटों द्वारा मापा गया।

सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, एकत्रित सुपरनैटेंट एक पारदर्शी टैन चिपचिपा तरल था। वर्षा तब शुरू हुई जब इस सतह पर तैरनेवाला को संतृप्त अमोनियम सल्फेट समाधान (नौ खंड) के साथ मिलाया गया था। 12 घंटे तक खड़े रहने के बाद, ट्यूब के तल पर एक भारी अवक्षेप बन गया था। जब इसे ट्रिस-एचसीएल बफर के साथ फिर से निलंबित किया गया, तो प्रोटीन अवक्षेप जल्दी से गायब हो गया और बफर में घुल गया, जो एक पारदर्शी पीले-पीले तरल के रूप में दिखाई दिया।

जब प्रोटीन समाधान को आर्जिनिन-एग्रोस मैट्रिक्स आत्मीयता स्तंभ पर लोड किया गया था, तो एक स्पष्ट शिखर (पीक 1, फ्लोथ्रू पीक) ~ 40 मिनट पर दिखाई दिया और ~ 66 मिनट पर सलामी देना बंद कर दिया। ढाल क्षालन चरण में, जब 0.15 M NaCl के साथ जोड़ा जाता है, तो एक स्पष्ट शिखर (शिखर 2, क्षालन शिखर) ~ 94 मिनट पर दिखाई देता है और ~ 110 मिनट पर सलामी देना बंद कर देता है। शेष क्षालन चरणों (0.25 मीटर, 0.35 मीटर, 0.45 मीटर, 0.55 मीटर और 0.65 मीटर एनएसीएल) में कोई स्पष्ट क्षालन चोटियां दिखाई नहीं दीं (चित्रा 1 ए)। इस अध्ययन में, हमने आर्जिनिन-एगारोस मैट्रिक्स आत्मीयता स्तंभ को 10 बार तक पुन: उपयोग किया और पाया कि कॉलम का प्रदर्शन काफी नहीं बदला था।

जब प्रोटीन समाधान को लाइसिन-एगारोस मैट्रिक्स आत्मीयता स्तंभ में लोड किया गया था, तो एक स्पष्ट शिखर (पीक 1, फ्लोथ्रू पीक) ~ 38 मिनट पर दिखाई दिया और ~ 60 मिनट पर सलामी देना बंद कर दिया। प्रवणता क्षालन अवस्था में, जब 0.15 M NaCl के साथ जोड़ा जाता है, तो एक स्पष्ट शिखर (शिखर 2, क्षालन शिखर) ~ 80 मिनट पर दिखाई देता है और ~ 86 मिनट पर सलामी देना बंद कर देता है। शेष क्षालन चरणों (0.25 मीटर, 0.35 मीटर, 0.45 मीटर, 0.55 मीटर, और 0.65 मीटर एनएसीएल (चित्रा 1 बी) में कोई स्पष्ट क्षालन चोटियां दिखाई नहीं दीं। आर्जिनिन-अगारोस मैट्रिक्स आत्मीयता स्तंभ और लाइसिन-एगारोस मैट्रिक्स आत्मीयता स्तंभ के क्षालन प्रोफाइल समान थे। जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, आर्जिनिन-एगारोस मैट्रिक्स आत्मीयता कॉलम को 10 बार तक पुन: उपयोग करने से इस कॉलम के प्रदर्शन में कोई बदलाव नहीं हुआ।

शुद्ध एसएफई (10 μL, क्षालन शिखर नमूना, पीक 2) तैयार फाइब्रिन प्लेट में जोड़ा गया था। इसके अलावा, क्रमशः सकारात्मक नियंत्रण, रिक्त और नकारात्मक नियंत्रण के लिए 10 μL यूरोकाइनेज (100 U), 10 μL शारीरिक खारा बफर, और 10 μL कच्चे प्रोटीन (प्रोटोकॉल चरण 1.3.1 में प्राप्त नमूना) का उपयोग किया गया था। इनक्यूबेशन के 18 घंटे के बाद, दो फाइब्रिन प्लेटों ने समान परिणाम प्रस्तुत किए: यूरोकाइनेज नियंत्रण में एक लाइसिंग ज़ोन (1.3 सेमी व्यास) दिखाई दिया; शारीरिक लवणीय बफर में कोई लाइसिंग ज़ोन नहीं देखा गया था; कच्चे प्रोटीन में एक लाइसिंग ज़ोन (2.1 सेमी व्यास) अच्छी तरह से दिखाई दिया; और शुद्ध एसएफई कुएं में एक लाइसिंग ज़ोन (1.8 सेमी व्यास) दिखाई दिया (चित्र 2)। यूरोकाइनेज की तुलना में, हमने पाया कि शुद्ध एसएफई की फाइब्रिनोलिटिक गतिविधि ~ 19,200 यू / एमएल थी। चूंकि क्षालन शिखर नमूने को आत्मीयता स्तंभ पर लोड किए गए नमूने के समान मात्रा में समायोजित किया गया था, इसलिए आत्मीयता स्तंभ की वसूली दर को फाइब्रिन प्लेट पर लाइसिंग ज़ोन के आकार (व्यास x व्यास) द्वारा इंगित किया जाता है। आत्मीयता स्तंभ की वसूली दर ~ 73.5% थी।

शुद्धता विश्लेषण के लिए कच्चे प्रोटीन (प्रोटोकॉल चरण 1.3.1 में प्राप्त नमूना) और शुद्ध एसएफई (क्षालन पीक नमूना, पीक 2) का उपयोग किया गया था। एसडीएस-पेज और धुंधला होने के बाद, कच्चे प्रोटीन में तीन प्रमुख प्रोटीन बैंड (25, 26, और 27 केडी) और छह मामूली बैंड (20, 24, 28, 35, 40 और 45 केडी) प्रस्तुत किए गए थे। एक प्रमुख बैंड (27 केडी) और दो छोटे बैंड (26 और 28 केडी) शुद्ध एसएफई (चित्रा 3) में प्रस्तुत किए गए थे। ग्रे मूल्य विश्लेषण के माध्यम से, हमने पाया कि शुद्ध एसएफई की शुद्धता ~ 92% जितनी अधिक थी।

Figure 1
चित्रा 1: आत्मीयता शुद्धिकरण की प्रोफ़ाइल। () कच्चे एसएफई नमूने को आर्जिनिन-एगारोस मैट्रिक्स आत्मीयता शुद्धिकरण द्वारा शुद्ध किया गया था। ~ 40 मिनट पर एक स्पष्ट प्रवाह शिखर दिखाई दिया और ~ 66 मिनट पर सलामी देना बंद कर दिया। एक स्पष्ट क्षालन शिखर ~ 94 मिनट पर दिखाई दिया और ~ 110 मिनट पर सलामी देना बंद कर दिया। (बी) कच्चे एसएफई नमूने को लाइसिन-एगारोस मैट्रिक्स आत्मीयता शुद्धिकरण द्वारा शुद्ध किया गया था। ~ 38 मिनट पर एक स्पष्ट प्रवाह शिखर दिखाई दिया और ~ 60 मिनट पर सलामी देना बंद कर दिया। एक स्पष्ट क्षालन शिखर ~ 80 मिनट पर दिखाई दिया और ~ 86 मिनट पर सलामी देना बंद कर दिया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: फाइब्रिनोलिटिक गतिविधि मूल्यांकन। नमूने फाइब्रिन प्लेट में जोड़े गए थे और उनकी फाइब्रिनोलिटिक गतिविधि को 18 घंटे के बाद प्लेट पर उनके अपमानजनक क्षेत्रों द्वारा मापा और मूल्यांकन किया गया था। अलग-अलग उपचारित नमूने लाल अरबी अंकों द्वारा इंगित किए जाते हैं। () आर्जिनिन-एगारोस मैट्रिक्स आत्मीयता स्तंभ द्वारा शुद्ध एसएफई की फाइब्रिनोलिटिक गतिविधि। # 1, यूरोकाइनेज के 100 यू; # 2, शारीरिक खारा बफर; # 3, क्रूड प्रोटीन (प्रोटोकॉल चरण 1.3.1 में प्राप्त नमूना); # 4, शुद्ध एसएफई (क्षालन शिखर नमूना, शिखर 2)। (बी) एसएफई की फाइब्रिनोलिटिक गतिविधि लाइसिन-एगारोस मैट्रिक्स आत्मीयता स्तंभ द्वारा शुद्ध की जाती है। # 1, यूरोकाइनेज के 100 यू; # 2, शारीरिक खारा बफर; # 3, क्रूड प्रोटीन (प्रोटोकॉल चरण 1.3.1 में प्राप्त नमूना); # 4, शुद्ध एसएफई (क्षालन शिखर नमूना, शिखर 2)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: शुद्धता विश्लेषण। शुद्ध एसएफई की शुद्धता का विश्लेषण एसडीएस-पेज द्वारा किया गया था। () आर्जिनिन-अगारोस मैट्रिक्स आत्मीयता स्तंभ द्वारा शुद्ध एसएफई की शुद्धता। एम: प्रोटीन मार्कर; लेन 1: क्रूड प्रोटीन (प्रोटोकॉल चरण 1.3.1 में प्राप्त नमूना); लेन 2: शुद्ध एसएफई (क्षालन शिखर नमूना, शिखर 2)। (बी) लाइसिन-एगारोस मैट्रिक्स आत्मीयता स्तंभ द्वारा शुद्ध एसएफई की शुद्धता। एम: प्रोटीन मार्कर; लेन 1: क्रूड प्रोटीन (प्रोटोकॉल चरण 1.3.1 में प्राप्त नमूना); लेन 2: शुद्ध एसएफई (क्षालन शिखर नमूना, शिखर 2)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 1: 8ZHP: snFPITE-n1 की क्रिस्टल संरचना। एक पीडीबी एक्स-रे संरचनात्मक सत्यापन रिपोर्ट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 2: 8ZHO: snFPITE-n2 की क्रिस्टल संरचना। एक पीडीबी एक्स-रे संरचनात्मक सत्यापन रिपोर्ट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

एसएफई के सटीक जीन अनुक्रम की अनुपलब्धता के कारण, वर्तमान में उपयोग किए जाने वाले एसएफई को ताजा एस नुडस14 से निकाला गया था। इसके अलावा, साहित्य में रिपोर्ट की गई एसएफई की शुद्धिकरण प्रक्रियाएं जटिल और महंगी थीं, क्योंकि वे एसएफई की कुछ सामान्य विशेषताओं पर आधारित थीं, जैसे आणविक भार, आइसोइलेक्ट्रिक बिंदु, आयनिक शक्ति और ध्रुवीयता15,16। एसएफई के किसी भी आत्मीयता शुद्धिकरण प्रोटोकॉल की आज तक रिपोर्ट नहीं की गई है। इस अध्ययन में, एसएफई का एक आत्मीयता शुद्धिकरण प्रोटोकॉल इसकी क्रिस्टल संरचना के ज्ञान के आधार पर सफलतापूर्वक विकसित किया गया था। रिपोर्ट की गई शुद्धिकरण विधियों की तुलना में, यह आत्मीयता शुद्धिकरण विधि संचालित करना आसान, सस्ती और उपयोगकर्ता के अनुकूल थी। इसके अलावा, इस विधि का उपयोग करके सक्रिय एसएफई की काफी अधिक वसूली दर देखी गई थी।

यद्यपि फाइब्रिनोलिटिक एंजाइमों के कई आत्मीयता शोधन विधियों की सूचना दी गई है, वे एंटीबॉडी17, अवरोधक 18, लिगेंड और रिसेप्टर्स16 पर आधारित थे। इन एंटीबॉडी, अवरोधक, लिगेंड और रिसेप्टर्स की तैयारी तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण और श्रमसाध्य है। इसके अलावा, इन अणुओं को मैट्रिक्स में संयुग्मित करने के लिए अतिरिक्त प्रयासों की आवश्यकता होती है। इसके विपरीत, आर्जिनिन-अगारोस मैट्रिक्स और लाइसिन-अगारोस मैट्रिक्स वाणिज्यिक सामग्री हैं, उपयोग के लिए तैयार, अत्यधिक स्थिर, औरस्केल करने में आसान हैं। हाल ही में, प्लास्मिनोजेन20,21 के आत्मीयता शुद्धिकरण के लिए लाइसिन-अगारोस मैट्रिक्स का उपयोग किया गया है; हालांकि, प्लास्मिनोजेन प्लास्मिन का प्रो-एंजाइम है, न कि सक्रिय रूप15। यह अनिश्चित है कि क्या लाइसिन-एगारोस मैट्रिक्स प्लास्मिन के आत्मीयता शुद्धिकरण के लिए उपयुक्त है। सैद्धांतिक रूप से, इस अध्ययन में आर्जिनिन-अगारोस मैट्रिक्स और लाइसिन-एगारोस मैट्रिक्स का उपयोग करके शुद्ध एसएफई केवल सक्रिय रूप है, क्योंकि क्रिस्टल मॉडल ने संकेत दिया है कि केवल एसएफई के उत्प्रेरक ट्रायड आर्जिनिन और लाइसिन अवशेषों के साथ बातचीत कर सकते हैं। इसलिए, इस प्रोटोकॉल को अन्य सेरीन प्लास्मिन के शुद्धिकरण में लागू किया जा सकता है, जिससे अन्य सेरीन प्लास्मिन दवाओं के विकास में तेजी आती है।

क्योंकि एसएफई और आत्मीयता स्तंभ के बीच बंधन बहुत मजबूत नहीं है, सफल शुद्धिकरण के लिए एक सटीक एनएसीएल एकाग्रता और उचित क्षालन गति बनाए रखना बहुत महत्वपूर्ण है। एक अन्य महत्वपूर्ण कारक सिस्टम का पीएच है, जो शुद्धिकरण को गंभीर रूप से प्रभावित करता है। इन तीन मापदंडों को हमारे द्वारा अनुकूलित किया गया है। बेशक, इस अध्ययन में सक्रिय एसएफई की वसूली दर अपेक्षाकृत कम थी, और एगारोस मैट्रिक्स की सतह पर उपलब्ध आर्गिनिन अवशेषों या लाइसिन अवशेषों की कम संख्या से प्रतिबंधित हो सकती है। इसलिए, लाइसिन / आर्जिनिन और एगारोस मैट्रिक्स के बीच लिंकर को इसकी वसूली दर को बढ़ाने के लिए लंबा करने की आवश्यकता है। इस बीच, हम इस संभावना को बाहर नहीं कर सकते हैं कि एसएफई के समान उत्प्रेरक त्रिकोण वाले अन्य सेरीन प्रोटीन को इस प्रणाली के तहत शामिल किया जाएगा। इसलिए, एसएफई से अन्य सेरीन प्रोटीन को अलग करने के लिए अल्ट्राफिल्ट्रेशन जैसे आणविक भार-आधारित शुद्धिकरण तकनीक को जोड़ना बेहतर है। इसी तरह, कई अन्य समस्याएं जैसे कि बाध्यकारी क्षमता को बढ़ाना, जीवनकाल को लंबा करना, और प्रक्रिया को और सरल बनाना रणनीतियों के अनुसार भविष्य के काम में संबोधित किया जाना चाहिए (उदाहरण के लिए, पॉली आर्जिनिन / लाइसिन के साथ आर्जिनिन / लाइसिन को प्रतिस्थापित करना और लिंकर का संशोधन)।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस शोध को ज़ियामेन सिटी के विज्ञान और प्रौद्योगिकी ब्यूरो (3502Z20227197) और फ़ुज़ियान प्रांत के विज्ञान और प्रौद्योगिकी ब्यूरो (संख्या 2019J01070, No.2021Y0027) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
30% Acrylamide-Bisacrylamide (29:1) Biosharp
2-Mercaptoethanol Solarbio
Agarose G-10 Biowest
Ammonium persulfate SINOPHARM
Ammonium sulfate SINOPHARM
Arginine-Sepharose 4B Solarbio Arginine-agarose matrix
Bromoxylenol Blue (BPB) Solarbio
Fast Silver Stain Kit Beyotime
Fibrinogen Merck
Glycine Solarbio
Hydrochloric acid SINOPHARM
Kinase RHAWN
Lysine-Sepharose 4B Solarbio Lysine-agarose matrix
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich
Prestained Color Protein Marker (10-170 kD) Beyotime
Sodium chloride SINOPHARM
Sodium Dodecyl Sulfonate (SDS) Sigma-Aldrich
Sodium hydroxide SINOPHARM
Thrombin Meilunbio
Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane Solarbio
Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane Hydrochloride Solarbio
Equipment
AKT Aprotein Purification System pure GE
Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer MLS-3750 SANYO
Chemiluminescence Imaging System GE
Constant Flow Pump BT-100 QITE
Constant Temperature Incubator JINGHONG
Desktop Refrigerated Centrifuge 3-30KS SIGMA
DHG Series Heating and Drying Oven DGG-9140AD SENXIN
Electric Glass Homogenizer DY89-II SCIENTZ
Electronic Analytical Balance DENVER
Electro-Thermostatic Water Bath DK-S12 SENXIN
Horizontal Decolorization Shaker Kylin-Bell
Ice Machine AF 103 Scotsman
KQ-500E Ultrasonic Cleaner ShuMei
Magnetic Stirrer Zhi wei
Micro Refrigerated Centrifuge H1650-W Cence
Microwave Oven Galanz
Milli-Q Reference Millipore
Pipettor Thermo Fisher Scientific
Precision Desktop pH Meter Sartorious
Small-sized Vortex Oscillator Kylin-Bell
Vertical Electrophoresis System Bio-Rad
Consumable Material 
200 µL PCR Tube (200 µL) Axygene
Centrifuge Tube (1.5 mL) Biosharp
Centrifuge Tube (5 mL) Biosharp
Centrifuge Tube (50 mL) NEST
Centrifuge Tube (7 mL) Biosharp
Culture Dish (60 mm) NEST
Filter Membrane (0.22 µm) Millex GP
Parafilm Bemis
Pipette Tip (1 mL ) KIRGEN
Pipette Tip (10 µL) Axygene
Pipette Tip (200 µL) Axygene
Special Indicator Paper TZAKZY
Ultra Centrifugal Filter Unit (15 mL 3 KDa) Millipore
Ultra Centrifugal Filter Unit (4 mL 3 KDa) Millipore
Universal pH Indicator SSS Reagent

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References

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इस महीने JoVE में अंक 196
<em>"सिपुन्कुलस न्यूडस</em> से फाइब्रिनोलिटिक एंजाइम का आत्मीयता शुद्धिकरण"।
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Tang, M., Lin, H., Hu, C., Yan, H.More

Tang, M., Lin, H., Hu, C., Yan, H. Affinity Purification of a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus. J. Vis. Exp. (196), e65631, doi:10.3791/65631 (2023).

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