Dræning af lymfeknudemetastasemodel til vurdering af dynamikken i antigenspecifikke CD8 + T-celler under tumorigenese
Summary
Det eksperimentelle design, der præsenteres her, giver en nyttig reproduktionsmodel til undersøgelser af antigenspecifikke CD8 + T-celler under lymfeknudemetastase (LN), hvilket udelukker forstyrrelse af tilskuer-CD8 + T-celler.
Abstract
Tumorantigenspecifikke CD8 + T-celler fra dræning af lymfeknuder får en akkumulerende betydning ved montering af antitumorimmunrespons under tumorgenese. Imidlertid danner kræftceller i mange tilfælde metastatiske loci i lymfeknuder, før de yderligere metastaserer til fjerne organer. I hvilket omfang de lokale og systematiske CD8 + T-celleresponser blev påvirket af LN-metastaser forbliver uklart. Til dette formål opsatte vi en murin LN-metastasemodel kombineret med en B16F10-GP melanomcellelinje, der udtrykker surrogatneoantigenet afledt af lymfocytisk choriomeningitisvirus (LCMV), glycoprotein (GP) og P14 transgene mus, der huser T-cellereceptorer (TCR’er), der er specifikke for GP-afledt peptid GP33-41 præsenteret af klasse I major histocompatibility complex (MHC) molekylet H-2Db. Denne protokol muliggør undersøgelse af antigenspecifikke CD8+ T-celleresponser under LN-metastase. I denne protokol blev C57BL/6J-mus subkutant implanteret med B16F10-GP-celler efterfulgt af adoptivoverførsel med naive P14-celler. Når den subkutane tumor voksede til ca. 5 mm i diameter, blev den primære tumor udskåret, og B16F10-GP-celler blev direkte injiceret i tumordrænende lymfeknude (TdLN). Derefter blev dynamikken i CD8 + T-celler overvåget under processen med LN-metastase. Samlet set har denne model givet en tilgang til præcist at undersøge de antigenspecifikke CD8 + T-celleimmunresponser under LN-metastase.
Introduction
Cancer immunterapi, især immuncheckpoint blokade (ICB), har revolutioneret kræftbehandling1. ICB blokerer de coinhibitory immunreceptorer (såsom PD-1, Tim-3, LAG-3 og TIGIT), som er stærkt udtrykt i udmattede CD8 + T-celler i tumormikromiljøet (TME), hvilket fører til genoplivning af udmattede CD8 + T-celler2. I betragtning af heterogeniteten af udmattede CD8 + T-celler afslørede akkumulerende beviser, at tumorspecifikke CD8 + T-celler afledt af periferien, herunder dræning af lymfeknude (dLN), men ikke i TME, medierer effekten af ICB 3,4,5,6,7,8. For nylig blev TdLN-afledte TCF-1 + TOX- tumorspecifikke hukommelses-CD8 + T-celler (TdLN-TTSM) bekræftet at være de ægte respondenter på ICB, som legemliggør flere funktionelle egenskaber ved konventionelle hukommelses-T-celler og yderligere kunne udvide og differentiere sig til afkomsudmattede celler ved ICB-behandling9. Alt i alt bekræftede disse resultater betydningen af LN i montering af antitumorimmunitet.
Lymfeknude fungerer som et kritisk sted for at lette priming og aktivering af tumorspecifikke CD8 + T-celler ved at tilvejebringe strukturelt grundlag såvel som biologiske signaler10. Flere typer kræftceller frø ofte sentinel lymfeknude (SLN, den første LN, der dræner en primær tumor) før systematisk spredning11. Tilstedeværelsen af SLN-metastaser er forbundet med dårligt resultat i human kræft, og prækliniske modeller viste, at tumorceller i TdLN kunne sprede sig til fjerne organer gennem både lymfekarrene og blodkarrene i knuden 12,13,14,15. SLN-biopsi repræsenterer nu en standardprocedure til vejledning af efterfølgende behandlingsbeslutninger i mange solide tumortyper, som kunne undgå unødvendig resektion af uinvolveret LN16,17. Selv for den involverede LN forbliver det kontroversielt, om og hvornår kirurgisk resektion er nødvendig, da flere undersøgelser har vist, at fjernelsen af regional LN ikke udviste forbedret samlet overlevelse sammenlignet med dem, der modtog stråling eller systemisk terapi uden regional LN-resektion 18,19. En fortolkning er, at metastatisk LN (mLN) med mikroskopisk sygdom kan bevare en vis kapacitet til at uddanne immunceller og give nogle terapeutiske fordele. Så det er kritisk vigtigt at belyse, hvordan LN-metastase påvirker antitumorimmunresponset, især egenskaberne og funktionerne af TdLN-TTSM.
Indtil nu har både prækliniske og kliniske data afsløret nogle strukturelle og cellulære ændringer i mLN20. Imidlertid er de dynamiske ændringer af tumorspecifikke CD8 + T-celler under LN-metastase ikke blevet afgrænset. Derfor er det nødvendigt at udvikle en overbevisende model af LN-metastase til yderligere undersøgelse. Faktisk har flere undersøgelser rapporteret mLN musemodeller på forskellige måder 14,21,22. For eksempel blev spontan metastase i aksillære LN’er udført gennem implantation af 4T1 brystkræftceller i brystfedtpuden22. I en anden undersøgelse genererede Reticker-Flynn et al. melanomcellelinjer med høj forekomst af spredning fra subkutan primær tumor til LN’er gennem seriel podning af tumorceller dyrket fra dissocieret mLN-væv (ni runder)14. En anden almindeligt anvendt model blev fremstillet ved injektion af tumorceller i fodpuden, og de metastatiske loci ville blive dannet i popliteal LN22. Især er det vanskeligt at evaluere de præcise tidspunkter for intervention, fordi LN-metastaser i disse modeller ikke altid er trofaste.
I denne undersøgelse blev en murine LN metastatisk model etableret gennem intranodal injektion af B16F10-GP-celler23,24, genereret ved CRISPR / Cas9-medieret indsættelse af LCMV-virusglycoprotein (GP) gensekvens i genomet af B16F10-cellelinje9. Derefter blev disse mus overført med P14-celler, der huser transgene T-cellereceptorer (TCR’er), genkender specifikt H-2Db GP33-41 epitop25,26, og den systemiske og lokale dynamik af antigenspecifikke CD8 + T-celler under LN-metastase kunne undersøges. Vores eksperimentelle design giver en nyttig model til undersøgelse af immunresponser, især de antigenspecifikke CD8 + T-celler under LN-metastasen, som udelukker forstyrrelse af tilskuere CD8 + T-celler. Disse resultater vil påvirke de kliniske behandlingsmuligheder for, om mLN skal fjernes eller bevares og kaste nyt lys over manipulation af mLN for at opnå maksimale terapeutiske fordele.
Protocol
Representative Results
Discussion
Under tumorgenese opsluger antigenpræsenterende celler (APC’er) tumorantigener og migrerer til TdLN, hvor de primer CD8 + T-celler. Efter priming og aktivering forlader CD8 + T-celler TdLN og infiltrerer tumoren for at dræbe tumorceller10. Gennem TdLN-resektion og administration af FTY720, som blokerer immuncellernes udgang fra lymfeorganerne, har flere undersøgelser vist TdLN’s afgørende rolle i at sikre effekten af PD-1/PD-L1 checkpoint-terapi34,35</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Science Foundation for Outstanding Young Scholars of China (nr. 82122028 til LX), National Natural Science Foundation of China (nr. 82173094 til LX), Natural Science Foundation of Chong Qing (nr. 2023NSCQ-BHX0087 til SW).
Materials
| 1.5 mL centrifuge tube | KIRGEN | KG2211 | |
| 100 U insulin syringe | BD Biosciences | 320310 | |
| 15 mL conical tube | BEAVER | 43008 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma | T48402-25G | |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma | 240486-100ML | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| APC anti-mouse CD45.1 | BioLegend | 110714 | Clone:A20 |
| B16-GP cell line | Beijing Biocytogen Co.Ltd, China | Custom | |
| BSA-V (bovine serum albumin) | Bioss | bs-0292P | |
| cell culture dish | BEAVER | 43701/43702/43703 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5810R-A462/5424R | |
| cyclophosphamide | Sigma | C0768-25G | |
| Cyclophosphamide (CTX) | Sigma | PHR1404 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EDTA | Sigma | EDS-500g | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352052 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
| flow cytometer | BD | FACSCanto II | |
| hemocytometer | PorLab Scientific | HM330 | |
| isoflurane | RWD life science | R510-22-16 | |
| KHCO3 | Sangon Biotech | A501195-0500 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | |
| needle carrier | RWD Life Science | F31034-14 | |
| NH4Cl | Sangon Biotech | A501569-0500 | |
| paraformaldehyde | Beyotime | P0099-500ml | |
| PE anti-mouse TCR Vα2 | BioLegend | 127808 | Clone:B20.1 |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100734 | Clone:53-6.7 |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758-500ML | |
| sodium azide | Sigma | S2002 | |
| surgical forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| surgical scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| suture thread | RWD Life Science | F34004-30 | |
| trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ml |
References
- Morad, G., Helmink, B. A., Sharma, P., Wargo, J. A. Hallmarks of response, resistance, and toxicity to immune checkpoint blockade. Cell. 184 (21), 5309-5337 (2021).
- Korman, A. J., Garrett-Thomson, S. C., Lonberg, N. The foundations of immune checkpoint blockade and the ipilimumab approval decennial. Nat Rev Drug Discov. 21 (7), 509-528 (2022).
- Chamoto, K., et al. Mitochondrial activation chemicals synergize with surface receptor PD-1 blockade for T cell-dependent antitumor activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (5), E761-E770 (2017).
- Spitzer, M. H., et al. Systemic immunity is required for effective cancer immunotherapy. Cell. 168 (3), 487-502 (2017).
- Yost, K. E., et al. Clonal replacement of tumor-specific T cells following PD-1 blockade. Nat Med. 25 (8), 1251-1259 (2019).
- Wu, T. D., et al. Peripheral T cell expansion predicts tumour infiltration and clinical response. Nature. 579 (7798), 274-278 (2020).
- Connolly, K. A., et al. A reservoir of stem-like cd8(+) t cells in the tumor-draining lymph node preserves the ongoing antitumor immune response. Sci Immunol. 6 (64), eabg7836 (2021).
- Schenkel, J. M., et al. Conventional type I dendritic cells maintain a reservoir of proliferative tumor-antigen specific Tcf-1+ CD8+ T cells in tumor-draining lymph nodes. Immunity. 54 (10), 2338-2353 (2021).
- Huang, Q., et al. The primordial differentiation of tumor-specific memory cd8(+) t cells as bona fide responders to pd-1/pd-l1 blockade in draining lymph nodes. Cell. 185 (22), 4049-4066 (2022).
- Kanda, Y., Okazaki, T., Katakai, T. Motility dynamics of T cells in tumor-draining lymph nodes: A rational indicator of antitumor response and immune checkpoint blockade. Cancers (Basel). 13 (18), 4616 (2021).
- Karaman, S., Detmar, M. Mechanisms of lymphatic metastasis. J Clin Invest. 124 (3), 922-928 (2014).
- Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).
- Brown, M., et al. Lymph node blood vessels provide exit routes for metastatic tumor cell dissemination in mice. Science. 359 (6382), 1408-1411 (2018).
- Reticker-Flynn, N. E., et al. Lymph node colonization induces tumor-immune tolerance to promote distant metastasis. Cell. 185 (11), 1924-1942 (2022).
- Leong, S. P., et al. Impact of nodal status and tumor burden in sentinel lymph nodes on the clinical outcomes of cancer patients. J Surg Oncol. 103 (6), 518-530 (2011).
- Lyman, G. H., et al. Sentinel lymph node biopsy for patients with early-stage breast cancer: American society of clinical oncology clinical practice guideline update. J Clin Oncol. 35 (5), 561-564 (2017).
- Wong, S. L., et al. Sentinel lymph node biopsy and management of regional lymph nodes in melanoma: American society of clinical oncology and society of surgical oncology clinical practice guideline update. Ann Surg Oncol. 25 (2), 356-377 (2018).
- Faries, M. B., et al. Completion dissection or observation for sentinel-node metastasis in melanoma. N Engl J Med. 376 (23), 2211-2222 (2017).
- Giuliano, A. E., et al. Effect of axillary dissection vs no axillary dissection on 10-year overall survival among women with invasive breast cancer and sentinel node metastasis: The ACOSOG Z0011 (alliance) randomized clinical trial. JAMA. 318 (10), 918-926 (2017).
- du Bois, H., Heim, T. A., Lund, A. W. Tumor-draining lymph nodes: At the crossroads of metastasis and immunity. Sci Immunol. 6 (63), eabg3551 (2021).
- An, S., et al. Locally trapping the c-c chemokine receptor type 7 by gene delivery nanoparticle inhibits lymphatic metastasis prior to tumor resection. Small. 15 (9), e1805182 (2019).
- Lee, C. K., et al. Tumor metastasis to lymph nodes requires yap-dependent metabolic adaptation. Science. 363 (6427), 644-649 (2019).
- Buchwald, Z. S., et al. Tumor-draining lymph node is important for a robust abscopal effect stimulated by radiotherapy. J ImmunoTher Cancer. 8 (2), e000867 (2020).
- Siddiqui, I., et al. Intratumoral Tcf1+PD-1+CD8+ T cells with stem-like properties promote tumor control in response to vaccination and checkpoint blockade immunotherapy. Immunity. 50 (1), 195.e10-211.e10 (2019).
- Ashton-Rickardt, P. G., et al. Evidence for a differential avidity model of T cell selection in the thymus. Cell. 76 (4), 651-663 (1994).
- Manjunath, N., et al. Effector differentiation is not prerequisite for generation of memory cytotoxic T lymphocytes. J Clin Invest. 108 (6), 871-878 (2001).
- Khan, O., et al. TOX transcriptionally and epigenetically programs CD8+ T cell exhaustion. Nature. 571 (7764), 211-218 (2019).
- North, R. J. Cyclophosphamide-facilitated adoptive immunotherapy of an established tumor depends on elimination of tumor-induced suppressor T cells. J Exp Med. 155 (4), 1063-1074 (1982).
- Maine, G. N., Mule, J. J. Making room for T cells. J Clin Invest. 110 (2), 157-159 (2002).
- Xue, G., et al. Adoptive cell therapy with tumor-specific th9 cells induces viral mimicry to eliminate antigen-loss-variant tumor cells. Cancer Cell. 39 (12), 1610.e9-1622.e9 (2021).
- Prokhnevska, N., et al. CD8+ T cell activation in cancer comprises an initial activation phase in lymph nodes followed by effector differentiation within the tumor. Immunity. 56 (1), 107.e5-124.e5 (2023).
- Wang, L., et al. Tumor transplantation for assessing the dynamics of tumor-infiltrating CD8+ T cells in mice. J Vis Exp. (172), e62442 (2021).
- Liu, Q., et al. Tumor-specific memory cd8(+) t cells are strictly resident in draining lymph nodes during tumorigenesis. Cell Mol Immunol. 20 (4), 423-426 (2023).
- Fransen, M. F., et al. Tumor-draining lymph nodes are pivotal in pd-1/pd-l1 checkpoint therapy. JCI Insight. 3 (23), e124507 (2018).
- Francis, D. M., et al. Blockade of immune checkpoints in lymph nodes through locoregional delivery augments cancer immunotherapy. Sci Transl Med. 12 (563), eaay3575 (2020).
- Garner, H., de Visser, K. E. Immune crosstalk in cancer progression and metastatic spread: A complex conversation. Nat Rev Immunol. 20 (8), 483-497 (2020).
