A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

Her giver vi en komplet protokol til at standardisere og implementere metoden til påvisning af SARS-CoV-2-virussen i humane prøver ved omvendt transkriptionsloop-medieret isotermisk amplifikation (RT-LAMP). Denne metode, der udføres inden for 60 minutter, kan tilpasses ethvert laboratorium eller behandlingssted til en lav pris og ved hjælp af billigt udstyr.

Abstract

Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) virus med alvorligt akut respiratorisk syndrom har haft en dramatisk indvirkning på menneskers sundhed. Det er fortsat en trussel mod det moderne samfund, fordi mange mennesker dør som følge af infektion. Sygdommen diagnosticeres ved hjælp af serologiske og molekylære tests, såsom guldstandarden realtidspolymerasekædereaktion (RT-PCR). Sidstnævnte har flere ulemper, fordi det kræver specialiseret infrastruktur, dyrt udstyr og uddannet personale. Her præsenterer vi en protokol, der skitserer de trin, der kræves for at detektere SARS-CoV-2-virussen ved hjælp af omvendt transkriptionsloop-medieret isotermisk amplifikation (RT-LAMP) i humane prøver. Protokollen indeholder instruktioner til design af primere i silico, fremstilling af reagenser, amplifikation og visualisering. Når den er standardiseret, kan denne metode nemt implementeres og tilpasses ethvert laboratorium eller behandlingssted inden for 60 minutter til en lav pris og ved hjælp af billigt udstyr. Det kan tilpasses til at påvise forskellige patogener. Således kan det potentielt bruges i marken og i sundhedscentre til at udføre rettidig epidemiologisk overvågning.

Introduction

Det alvorlige akutte respiratoriske syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) forårsager coronavirussygdom 2019 (COVID-19). Verdenssundhedsorganisationen erklærede en folkesundhedsmæssig krisesituation af international betydning den 30. januar 2020 og en pandemi den 11. marts 2020. Pandemien resulterede i over 760 millioner tilfælde og 6,87 millioner dødsfald på den dato, hvor denne artikel blev skrevet¹.

Virkningen af denne virus har understreget behovet for bedre, mere præcise, hurtigere og mere bredt tilgængelige overvågningsværktøjer for at forbedre påvisning og kontrol af infektionssygdomme ^2,3. Under pandemien var SARS-CoV-2 diagnostiske tests baseret på påvisning af nukleinsyre, antistoffer og proteiner, men RT-PCR-påvisning af nukleinsyre er guldstandarden⁴. RT-PCR har dog nogle begrænsninger; Det kræver specialiseret udstyr, infrastruktur og personale uddannet i molekylærbiologi, hvilket begrænser dets anvendelse til specialiserede laboratorier. Yderligere er det tidskrævende (4-6 timer), ikke medregnet tiden til at transportere prøverne til laboratoriet, hvilket kan tage dage⁵. Disse begrænsninger forhindrer effektiv prøvebehandling og opnåelse af de oplysninger, der er nødvendige for beredskabsplanlægning og epidemiologisk styring.

Omvendt transkriptionsloop-medieret isotermisk amplifikation (RT-LAMP) har flere fordele i forhold til RT-PCR, hvilket gør det til en tiltalende strategi til design af fremtidige diagnostiske tests (POCT), især i ressourcebegrænsede omgivelser⁶. For det første er den meget specifik, fordi den bruger mellem fire og seks primere, der genkender seks til otte områder i målsekvensen, det være sig DNA eller RNA ^7,8. For det andet, fordi det fungerer ved en konstant temperatur, kræver det ikke sofistikeret udstyr såsom termiske cykler i realtid for at generere forstærkningen, og det kræver heller ikke højtuddannet personale at betjene det. For det tredje er reaktionstiden meget kort (~60 min), og der anvendes reagenser, der ikke er særlig specialiserede, hvilket gør det til et omkostningseffektivt værktøj⁶. I betragtning af ovenstående og den sundhedsmæssige nødsituation forårsaget af COVID-19-pandemien kan denne teknik ses som en alternativ diagnostisk metode, der er hurtig, billig og enkel at implementere i ethvert forskningslaboratorium⁹.

Protokollen til standardisering og implementering af en RT-LAMP til detektering af SARS-CoV-2 ved hjælp af kolorimetriske metoder ved hjælp af en termocykler og et vandbad er beskrevet i denne artikel (figur 1). Kritiske punkter, deres begrænsninger og alternativer til at fremme dem diskuteres.

Figur 1: Skema over protokollen til amplifikation af SARS-CoV-2 ved hjælp af RT-LAMP-teknikken. Klik her for at se en større version af denne figur.

Protocol

De anvendte prøver blev leveret af det kliniske laboratorium på Fundación Valle del Lili Universitetshospital og svarede til det oprensede RNA fra patienter, der testede positive for COVID-19 ved hjælp af RT-qPCR-teknikken. Alle patienter gav informeret samtykke til forskning, og denne undersøgelse blev godkendt af den bioetiske komité for menneskelige undersøgelser fra Fundación Valle del Lili Universitetshospital. 1. RT-LAMP primer design og forberedelse <p class="…

Representative Results

Implementeringen af protokollen starter med at designe sættet af primere for hvert målgen efter protokollen beskrevet ovenfor. I juni 2020 blev 5.000 SARS-CoV-2-genomer opnået fra NextStrain databasen med en 10 % repræsentativitet af colombianske genomer. Disse sekvenser blev justeret for at opnå den konsensussekvens, der blev brugt i primerdesignprocessen. Tabel 1 viser det primersæt, der er valgt for primerne RdRp/Hel og RdRp. Primersættet for gen N-amplifikation blev opnået fra en tidligere of…

Discussion

Selvom RT-LAMP betragtes som en komplementær metode til udførelse af molekylær diagnostik, har den også nogle begrænsninger og kritiske trin, der skal overvejes, når protokollen standardiseres og implementeres.

LAMP-standardiseringen til detektion af SARS-CoV-2 evaluerede følgende parametre og komponenter i masterblandingen: (a) koncentration og temperatur for justering af primerne; b) koncentrationen af enzymerne c) magnesiumkoncentration d) reaktionstid e) tilsætningsstoffer som BSA,…

Materials

1 kb DNA Ladder	SOLIS BIODYNE	07-12-00050	Store at -20 °C
50x TAE Electrophoresis Buffer	ThermoScientific	B49	Store at roome temperature
Accuris High Fidelity Polymerase	ACCURIS LIFE SCIENCE REAGENTS	PR1000-HF-200	It can be used in case Q5 High-Fidelity DNA polymerase cannot be purchased. For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use.
Agarose	PanReacAppliChem	A8963,0100	N/A
Bst 3.0 DNA Polymerase 8000 IU/mL	New England BioLabs	M0374S/M0374L	For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use.
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set	New England BioLabs	N0446S	Store at -20 °C
Diethyl pyrocarbonate	Sigma-Aldrich	159220-25G	Handle it with caution under an extraction cabinet
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder, ready-to-use	ThermoScientific	SM0322	Store at -20 °C
Hydroxy naphthol blue disodium salt	Santa Cruz Biotechnology	sc-215156B	N/A
Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2000 IU/mL	New England BioLabs	M0491S/M0491L	For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use.
WarmStart RTx Reverse Transcriptase 15000 IU/mL	New England BioLabs	M0380S/M0380L	For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use.