Charakterisierung der Gefäßmorphologie der neovaskulären altersbedingten Makuladegeneration durch Indocyaningrün-Angiographie
Summary
Derzeit ist die Fluoreszenzangiographie (FA) die bevorzugte Methode zur Identifizierung von Leckagemustern in Tiermodellen der choroidalen Neovaskularisation (CNV). FA liefert jedoch keine Informationen über die Gefäßmorphologie. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung der Indocyaningrün-Angiographie (ICGA) zur Charakterisierung verschiedener Läsionstypen von laserinduzierter CNV in Mausmodellen.
Abstract
Die altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist eine der Hauptursachen für Erblindung bei älteren Menschen, und ihre Prävalenz nimmt aufgrund der alternden Bevölkerung rapide zu. Die choroidale Neovaskularisation (CNV) oder feuchte AMD, die 10 % bis 20 % aller AMD-Fälle ausmacht, ist für alarmierende 80 % bis 90 % der AMD-bedingten Blindheit verantwortlich. Aktuelle Anti-VEGF-Therapien zeigen bei etwa 50 % der Patienten ein suboptimales Ansprechen. Die Resistenz gegen eine Anti-VEGF-Behandlung bei CNV-Patienten ist häufig mit arteriolärer CNV verbunden, während die Responder tendenziell kapillare CNV haben. Während die Fluoreszenzangiographie (FA) häufig zur Beurteilung von Leckagemustern bei Patienten mit feuchter AMD und Tiermodellen verwendet wird, liefert sie keine Informationen über die Gefäßmorphologie der CNV (arterioläre CNV vs. kapillare CNV). Dieses Protokoll führt die Verwendung der Indocyaningrün-Angiographie (ICGA) zur Charakterisierung von Läsionstypen in laserinduzierten CNV-Mausmodellen ein. Diese Methode ist entscheidend für die Untersuchung der Mechanismen und Behandlungsstrategien für Anti-VEGF-Resistenzen bei feuchter AMD. Es wird empfohlen, ICGA zusammen mit FA zu integrieren, um sowohl die Leckage als auch die vaskulären Merkmale von CNV in mechanistischen und therapeutischen Studien umfassend zu beurteilen.
Introduction
Die altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist eine weit verbreitete Erkrankung, die bei älteren Menschen zu schwerem Sehverlust führt1. Allein in den Vereinigten Staaten wird sich die Zahl der AMD-Patienten voraussichtlich verdoppeln und bis 2050 fast 22 Millionen erreichen, verglichen mit den derzeitigen 11 Millionen. Weltweit wird die geschätzte Zahl der AMD-Fälle bis 2040 voraussichtlich 288 Millionen erreichen2.
Die choroidale Neovaskularisation (CNV), auch bekannt als “feuchte” oder neovaskuläre AMD, kann aufgrund der Bildung abnormaler Blutgefäße unter der zentralen Netzhaut verheerende Auswirkungen auf das Sehvermögen haben. Dies führt zu Blutungen, Netzhautexsudation und erheblichem Sehverlust. Die Einführung von Therapien mit antivaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor (VEGF), die auf extrazelluläres VEGF abzielen, hat die CNV-Behandlung revolutioniert. Trotz dieser Fortschritte zeigen jedoch bis zu 50 % der Patienten ein suboptimales Ansprechen auf diese Therapien, mit anhaltender Krankheitsaktivität wie Flüssigkeitsansammlung und ungelösten oder neuen Blutungen 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14.
Klinische Studien haben gezeigt, dass die Anti-VEGF-Resistenz bei CNV-Patienten häufig dem Vorhandensein einer arteriolären CNV entspricht, die durch großkalibrige verzweigte Arteriolen, Gefäßschlingen und Anastomosenverbindungen gekennzeichnetist 9. Eine wiederholte Anti-VEGF-Behandlung kann zur Gefäßanomalisierung, zur Entwicklung einer arteriolären CNV und letztendlich zur Resistenz gegen Anti-VEGF-Therapien beitragen14,15. Bei arteriolärem CNV ist ein anhaltender Flüssigkeitsaustritt wahrscheinlich auf eine erhöhte Exsudation zurückzuführen, die durch unzureichend ausgebildete Tight Junctions an arteriovenösen Anastomosenschleifen verursacht wird, insbesondere unter Bedingungen hoher Durchblutung9. Umgekehrt neigen Personen, die gut auf eine Anti-VEGF-Behandlung ansprechen, dazu, kapillares CNV zu zeigen.
In unseren Studien mit Tiermodellen haben wir gezeigt, dass laserinduziertes CNV bei älteren Mäusen arterioläre CNV entwickelt und eine Resistenz gegen eine Anti-VEGF-Behandlung zeigt16,17. Umgekehrt führt laserinduziertes CNV bei jüngeren Mäusen zur Entwicklung von kapillarem CNV und zu einem hohen Ansprechen auf eine Anti-VEGF-Behandlung. Daher ist es sowohl für mechanistische als auch für therapeutische Untersuchungen von entscheidender Bedeutung, zwischen CNV-Gefäßtypen zu unterscheiden.
In klinischen Umgebungen wird CNV üblicherweise auf der Grundlage von Fluoreszenzangiographie (FA)-Leckagemustern (z. B. Typ 1, Typ 2) klassifiziert, die Fluoreszeinfarbstoff verwenden, um Exsudation zu verfolgen und Bereiche mit pathologischer Leckage zu identifizieren. In der AMD-Forschung wird CNV überwiegend mit FA in Tiermodellen untersucht. Die FA zeigt jedoch nicht die vaskuläre Morphologie von CNV. Darüber hinaus nimmt FA nur Bilder im sichtbaren Lichtspektrum auf und kann das Aderhautgefäßsystem unter dem retinalen Pigmentepithel (RPE) nicht sichtbar machen. Im Gegensatz dazu erleichtert Indocyaningrün (ICG), das eine starke Affinität zu Plasmaproteinen aufweist, die vorherrschende intravaskuläre Retention und ermöglicht die Visualisierung der Gefäßstruktur und des Blutflusses9. Durch die Nutzung der Nahinfrarot-Fluoreszenzeigenschaft von ICG wird es möglich, das Netzhaut- und Aderhautpigment mittels ICG-Angiographie (ICGA) abzubilden. In diesem Zusammenhang wird ein Protokoll vorgestellt, das FA und ICGA kombiniert, um die Leckage und Gefäßmorphologie der laserinduzierten choroidalen Neovaskularisation (CNV) bei jungen und alten Mäusen zu untersuchen, bei denen kapillare und arterioläre CNV beobachtet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Studie demonstrierte die Verwendung der Indocyaningrün-Angiographie (ICGA) zur Identifizierung der vaskulären Morphologie der arteriolären und kapillaren choroidalen Neovaskularisation (CNV) in Mausmodellen mit laserinduzierter CNV. Die hämoglobingebundenen und infraroten Lichteigenschaften des Farbstoffs Indocyaningrün (ICG) ermöglichten den Nachweis der CNV-Morphologie, was mit der Fluoreszenzangiographie (FA), der aktuellen Methode der Forschungsgemeinschaft, nur schwer zu erreichen ist.
<p class="jove…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der BrightFocus Foundation, der Retina Research Foundation, der Mullen Foundation und des Sarah Campbell Blaffer Endowment in Ophthalmology an YF, den NIH-Kernzuschuss 2P30EY002520 an das Baylor College of Medicine und einen uneingeschränkten Zuschuss an die Abteilung für Augenheilkunde am Baylor College of Medicine von Research to Prevent Blindness unterstützt.
Materials
| 32-G Insulin Syringe | MHC Medical Products | NDC 08496-3015-01 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen | A11008 | |
| Anti-α smooth muscle Actin antibody | Abcam | ab5694 | |
| Bovine Serum Albumin | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-2323 | |
| C57BL/6J mice (7-9 weeks) | The Jackson Laboratory | Strain #:000664 | |
| Fluorescein Sodium Salt | Sigma-Aldrich | MFCD00167039 | |
| Gaymar T Pump Heat Therapy System | Gaymar | TP-500 | Water circulation heat pump for mouse recovery after imaging |
| GenTeal Gel | Genteal | NDC 58768-791-15 | Clear lubricant eye gel |
| GS-IB4 Alexa-Flour 568 conjugate | Invitrogen | I21412 | |
| Heidelberg Eye Explorerer | Heidelberg Engineering, Germany | HEYEX2 | |
| Indocyanine Green | Pfaultz & Bauer | I01250 | |
| Ketamine | Vedco Inc. | NDC 50989-996-06 | |
| Paraformaldehyde | Acros Organics | 416785000 | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution (0.5%) | Sandoz | NDC 61314-016-01 | |
| Spectralis Multi-Modality Imaging System Heidelberg Engineering, Germany SPECTRALIS HRA+OCT Tropicamide ophthalmic solution (1%) Bausch & Lomb NDC 24208-585-64 for dilation of pupils GenTeal Gel Genteal NDC 58768-791-15 clear lubricant eye gel Ketamine Vedco Inc NDC 50989-996-06 Xylazine Lloyd Laboratories NADA 139-236 Acepromazine Vedco Inc NDC 50989-160-11 32-G Needle Steriject PRE-32013 1-ml syringe BD 309659 Indocyanine Green Pfaltz & Bauer I01250 | Heidelberg Engineering, Germany | SPECTRALIS HRA+OCT | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-1L | |
| Tropicamide ophthalmic solution (1%) | Bausch & Lomb | NDC 24208-585-64 | For dilation of pupils |
| Xylazine | Lloyd Laboratories | NADA 139-236 |
References
- Fleckenstein, M., et al. Age-related macular degeneration. Nature Reviews Disease Primers. 7 (1), 1-25 (2021).
- Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 2 (2), e106-e116 (2014).
- Maguire, M. G., et al. Five-Year outcomes with anti-vascular endothelial growth factor treatment of neovascular age-related macular degeneration: the comparison of age-related macular degeneration treatments trials. Ophthalmology. 123 (8), 1751-1761 (2016).
- Yang, S., Zhao, J., Sun, X. Resistance to anti-VEGF therapy in neovascular age-related macular degeneration: a comprehensive review. Drug Design, Development and Therapy. 10, 1857-1867 (2016).
- Ehlken, C., Jungmann, S., Böhringer, D., Agostini, H. T., Junker, B., Pielen, A. Switch of anti-VEGF agents is an option for nonresponders in the treatment of AMD. Eye. 28 (5), 538-545 (2014).
- Heier, J. S., et al. Intravitreal aflibercept (VEGF trap-eye) in wet age-related macular degeneration. Ophthalmology. 119 (12), 2537-2548 (2012).
- Rofagha, S., Bhisitkul, R. B., Boyer, D. S., Sadda, S. R., Zhang, K. SEVEN-UP Study Group Seven-year outcomes in ranibizumab-treated patients in ANCHOR, MARINA, and HORIZON: a multicenter cohort study (SEVEN-UP). Ophthalmology. 120 (11), 2292-2299 (2013).
- Krebs, I., Glittenberg, C., Ansari-Shahrezaei, S., Hagen, S., Steiner, I., Binder, S. Non-responders to treatment with antagonists of vascular endothelial growth factor in age-related macular degeneration. British Journal of Ophthalmology. 97 (11), 1443-1446 (2013).
- Mettu, P. S., Allingham, M. J., Cousins, S. W. Incomplete response to Anti-VEGF therapy in neovascular AMD: Exploring disease mechanisms and therapeutic opportunities. Progress in Retinal and Eye Research. 82, 100906 (2021).
- Otsuji, T., et al. Initial non-responders to ranibizumab in the treatment of age-related macular degeneration (AMD). Clinical Ophthalmology (Auckland, N.Z). 7, 1487-1490 (2013).
- Cobos, E., et al. Association between CFH, CFB, ARMS2, SERPINF1, VEGFR1 and VEGF polymorphisms and anatomical and functional response to ranibizumab treatment in neovascular age-related macular degeneration. Acta Ophthalmologica. 96 (2), e201-e212 (2018).
- Kitchens, J. W., et al. A pharmacogenetics study to predict outcome in patients receiving anti-VEGF therapy in age related macular degeneration. Clinical Ophthalmology (Auckland, N.Z.). 7, 1987-1993 (2013).
- Rosenfeld, P. J., Shapiro, H., Tuomi, L., Webster, M., Elledge, J., Blodi, B. Characteristics of patients losing vision after 2 Years of monthly dosing in the phase III Ranibizumab clinical trials. Ophthalmology. 118 (3), 523-530 (2011).
- Spaide, R. F. Optical coherence tomography angiography signs of vascular abnormalization with antiangiogenic therapy for choroidal neovascularization. American Journal of Ophthalmology. 160 (1), 6-16 (2015).
- Lumbroso, B., Rispoli, M., Savastano, M. C., Jia, Y., Tan, O., Huang, D. Optical coherence tomography angiography study of choroidal neovascularization early response after treatment. Developments in Ophthalmology. 56, 77-85 (2016).
- Zhu, L., et al. Combination of apolipoprotein-A-I/apolipoprotein-A-I binding protein and anti-VEGF treatment overcomes anti-VEGF resistance in choroidal neovascularization in mice. Communications Biology. 3 (1), 386 (2020).
- Zhang, Z., Shen, M. M., Fu, Y. Combination of AIBP, apoA-I, and Aflibercept overcomes anti-VEGF resistance in neovascular AMD by inhibiting arteriolar choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (12), 2 (2022).
- Koehn, D., Meyer, K. J., Syed, N. A., Anderson, M. G. Ketamine/Xylazine-induced corneal damage in mice. PloS One. 10 (7), e0132804 (2015).
- Li, X. -. T., Qin, Y., Zhao, J. -. Y., Zhang, J. -. S. Acute lens opacity induced by different kinds of anesthetic drugs in mice. International Journal of Ophthalmology. 12 (6), 904-908 (2019).
- Zhou, T. E., et al. Preventing corneal calcification associated with xylazine for longitudinal optical coherence tomography in young rodents. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (1), 461-469 (2017).
- Ikeda, W., Nakatani, T., Uemura, A. Cataract-preventing contact lens for in vivo imaging of mouse retina. BioTechniques. 65 (2), 101-104 (2018).
- Kumar, S., Berriochoa, Z., Jones, A. D., Fu, Y. Detecting abnormalities in choroidal vasculature in a mouse model of age-related macular degeneration by time-course indocyanine green angiography. Journal of Visualized Experiments. 84, e51061 (2014).
