אפיון מורפולוגיה וסקולרית של ניוון מקולרי נאו-וסקולרי הקשור לגיל על ידי אינדוציאנין אנגיוגרפיה ירוקה
Summary
נכון לעכשיו, אנגיוגרפיה פלואורסצאין (FA) היא השיטה המועדפת לזיהוי דפוסי דליפה במודלים של בעלי חיים של ניאו-וסקולריזציה כורואידית (CNV). עם זאת, FA אינו מספק מידע על מורפולוגיה של כלי הדם. פרוטוקול זה מתאר את השימוש באנגיוגרפיה ירוקה אינדוציאנינית (ICGA) כדי לאפיין סוגים שונים של נגעים של CNV המושרה בלייזר במודלים של עכברים.
Abstract
ניוון מקולרי תלוי גיל (AMD) הוא גורם מוביל לעיוורון בקרב אנשים מבוגרים, ושכיחותו עולה במהירות עקב הזדקנות האוכלוסייה. ניאו-וסקולריזציה כורואידית (CNV) או AMD רטוב, המהווה 10%-20% מכלל מקרי AMD, אחראית ל-80%-90% מדאיגים של עיוורון הקשור ל-AMD. הטיפולים הנוכחיים נגד VEGF מראים תגובות תת-אופטימליות בכ-50% מהמטופלים. עמידות לטיפול נגד VEGF בחולי CNV קשורה לעיתים קרובות ל- CNV עורקי, בעוד שהמגיבים נוטים להיות CNV נימי. בעוד אנגיוגרפיה פלואורסצאין (FA) משמשת בדרך כלל להערכת דפוסי דליפה בחולי AMD רטובים ובמודלים של בעלי חיים, היא אינה מספקת מידע על מורפולוגיה וסקולרית של CNV (CNV עורקי לעומת CNV נימי). פרוטוקול זה מציג את השימוש באנגיוגרפיה ירוקה אינדוציאנינית (ICGA) כדי לאפיין סוגי נגעים במודלים של עכברי CNV המושרים בלייזר. שיטה זו חיונית לחקר המנגנונים ואסטרטגיות הטיפול בעמידות נגד VEGF ב- AMD רטוב. מומלץ לשלב ICGA לצד FA להערכה מקיפה של דליפה ותכונות כלי דם של CNV במחקרים מכניסטיים וטיפוליים.
Introduction
ניוון מקולרי הקשור לגיל (AMD) הוא מצב שכיח המוביל לאובדן ראייה חמור אצל אנשים מבוגרים1. בארצות הברית לבדה, מספר חולי AMD צפוי להכפיל את עצמו, ולהגיע לכמעט 22 מיליון עד 2050, לעומת 11 מיליון כיום. ברחבי העולם, המספר המשוער של מקרי AMD צפוי להגיע ל -288 מיליון מדהים עד 20402.
Choroidal neovascularization (CNV), הידוע גם בשם AMD “רטוב” או neovascular, יכול להיות השפעות הרסניות על הראייה עקב היווצרות של כלי דם חריגים מתחת הרשתית המרכזית. זה מוביל לדימום, הפרשה ברשתית ואובדן ראייה משמעותי. הכנסת טיפולים אנטי-וסקולריים בגורם גדילה אנדותל (VEGF), המכוונים ל-VEGF חוץ-תאי, חוללה מהפכה בטיפול ב-CNV. עם זאת, למרות התקדמות זו, עד 50% מהחולים מפגינים תגובות תת-אופטימליות לטיפולים אלה, עם פעילות מחלה מתמשכת כגון הצטברות נוזלים ודימומים לא פתורים או חדשים 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14.
מחקרים קליניים הצביעו על כך שעמידות נגד VEGF בחולי CNV תואמת לעתים קרובות לנוכחות של CNV עורקי, המאופיינת בעורקים מסתעפים בקליבר גדול, לולאות כלי דם וקשרים אנסטומטיים9. טיפול חוזר נגד VEGF יכול לתרום לנורמליזציה של כלי הדם, להתפתחות CNV עורקי, ובסופו של דבר, עמידות לטיפולים נגד VEGF14,15. במקרים של CNV עורקי, דליפת נוזלים מתמשכת נובעת ככל הנראה מהפרשה מוגברת הנגרמת על ידי צמתים הדוקים שלא נוצרו כראוי בלולאות אנסטומוטיות עורקיות, במיוחד בתנאים של זרימת דם גבוהה9. לעומת זאת, אנשים שמגיבים היטב לטיפול נגד VEGF נוטים להציג CNV נימי.
במחקרים שלנו המשתמשים במודלים של בעלי חיים, הראינו כי CNV המושרה בלייזר בעכברים מבוגרים מפתח CNV עורקי ומראה עמידות לטיפול נגד VEGF16,17. לעומת זאת, CNV המושרה בלייזר בעכברים צעירים מוביל להתפתחות של CNV נימי והיענות גבוהה לטיפול נגד VEGF. לכן, חיוני להבדיל בין סוגי כלי דם CNV הן לחקירות מכניסטיות והן טיפוליות.
במסגרות קליניות, CNV מסווג בדרך כלל בהתבסס על דפוסי דליפת אנגיוגרפיה פלואורסצאין (FA) (למשל, סוג 1, סוג 2), המשתמשים בצבע פלואורסצאין כדי לעקוב אחר הפרשה ולזהות אזורים של דליפה פתולוגית. במחקר AMD, CNV נחקר בעיקר באמצעות FA במודלים של בעלי חיים. עם זאת, FA אינו חושף את המורפולוגיה של כלי הדם של CNV. יתר על כן, FA לוכד רק תמונות בספקטרום האור הנראה ואינו יכול לדמיין את כלי הדם הכורואידיים מתחת לאפיתל פיגמנט הרשתית (RPE). לעומת זאת, אינדוציאנין ירוק (ICG), המציג זיקה חזקה לחלבוני פלזמה, מאפשר שימור תוך כלי דם דומיננטי ומאפשר הדמיה של מבנה כלי הדם וזרימת הדם9. על ידי ניצול התכונה הפלואורסצנטית התת-אדומה הקרובה של ICG, ניתן לצלם את הפיגמנט הרשתית והכורואידי באמצעות אנגיוגרפיה של ICG (ICGA). בהקשר זה, מוצג פרוטוקול המשלב FA ו- ICGA כדי לחקור את הדליפה ואת המורפולוגיה של כלי הדם של ניאו-וסקולריזציה כורואידית הנגרמת על ידי לייזר (CNV) בעכברים צעירים ומבוגרים, שם נצפה CNV נימי ועורקי.
Protocol
Representative Results
Discussion
מחקר זה הדגים את השימוש באנגיוגרפיה ירוקה אינדוציאנינית (ICGA) כדי לזהות את המורפולוגיה של כלי הדם של ניאו-וסקולריזציה כורואידית עורקית ונימי (CNV) במודלים של עכברים עם CNV המושרה בלייזר. תכונות האור הקשור להמוגלובין והאינפרא אדום של צבע ירוק אינדוציאנין (ICG) אפשרו זיהוי של מורפולוגיה CNV, דבר מא?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מקרן BrightFocus, קרן מחקר הרשתית, קרן Mullen וקרן שרה קמפבל בלאפר ברפואת עיניים ל- YF, מענק ליבה של NIH 2P30EY002520 למכללת ביילור לרפואה, ומענק בלתי מוגבל למחלקה לרפואת עיניים במכללת ביילור לרפואה ממחקר למניעת עיוורון.
Materials
| 32-G Insulin Syringe | MHC Medical Products | NDC 08496-3015-01 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen | A11008 | |
| Anti-α smooth muscle Actin antibody | Abcam | ab5694 | |
| Bovine Serum Albumin | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-2323 | |
| C57BL/6J mice (7-9 weeks) | The Jackson Laboratory | Strain #:000664 | |
| Fluorescein Sodium Salt | Sigma-Aldrich | MFCD00167039 | |
| Gaymar T Pump Heat Therapy System | Gaymar | TP-500 | Water circulation heat pump for mouse recovery after imaging |
| GenTeal Gel | Genteal | NDC 58768-791-15 | Clear lubricant eye gel |
| GS-IB4 Alexa-Flour 568 conjugate | Invitrogen | I21412 | |
| Heidelberg Eye Explorerer | Heidelberg Engineering, Germany | HEYEX2 | |
| Indocyanine Green | Pfaultz & Bauer | I01250 | |
| Ketamine | Vedco Inc. | NDC 50989-996-06 | |
| Paraformaldehyde | Acros Organics | 416785000 | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution (0.5%) | Sandoz | NDC 61314-016-01 | |
| Spectralis Multi-Modality Imaging System Heidelberg Engineering, Germany SPECTRALIS HRA+OCT Tropicamide ophthalmic solution (1%) Bausch & Lomb NDC 24208-585-64 for dilation of pupils GenTeal Gel Genteal NDC 58768-791-15 clear lubricant eye gel Ketamine Vedco Inc NDC 50989-996-06 Xylazine Lloyd Laboratories NADA 139-236 Acepromazine Vedco Inc NDC 50989-160-11 32-G Needle Steriject PRE-32013 1-ml syringe BD 309659 Indocyanine Green Pfaltz & Bauer I01250 | Heidelberg Engineering, Germany | SPECTRALIS HRA+OCT | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-1L | |
| Tropicamide ophthalmic solution (1%) | Bausch & Lomb | NDC 24208-585-64 | For dilation of pupils |
| Xylazine | Lloyd Laboratories | NADA 139-236 |
References
- Fleckenstein, M., et al. Age-related macular degeneration. Nature Reviews Disease Primers. 7 (1), 1-25 (2021).
- Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 2 (2), e106-e116 (2014).
- Maguire, M. G., et al. Five-Year outcomes with anti-vascular endothelial growth factor treatment of neovascular age-related macular degeneration: the comparison of age-related macular degeneration treatments trials. Ophthalmology. 123 (8), 1751-1761 (2016).
- Yang, S., Zhao, J., Sun, X. Resistance to anti-VEGF therapy in neovascular age-related macular degeneration: a comprehensive review. Drug Design, Development and Therapy. 10, 1857-1867 (2016).
- Ehlken, C., Jungmann, S., Böhringer, D., Agostini, H. T., Junker, B., Pielen, A. Switch of anti-VEGF agents is an option for nonresponders in the treatment of AMD. Eye. 28 (5), 538-545 (2014).
- Heier, J. S., et al. Intravitreal aflibercept (VEGF trap-eye) in wet age-related macular degeneration. Ophthalmology. 119 (12), 2537-2548 (2012).
- Rofagha, S., Bhisitkul, R. B., Boyer, D. S., Sadda, S. R., Zhang, K. SEVEN-UP Study Group Seven-year outcomes in ranibizumab-treated patients in ANCHOR, MARINA, and HORIZON: a multicenter cohort study (SEVEN-UP). Ophthalmology. 120 (11), 2292-2299 (2013).
- Krebs, I., Glittenberg, C., Ansari-Shahrezaei, S., Hagen, S., Steiner, I., Binder, S. Non-responders to treatment with antagonists of vascular endothelial growth factor in age-related macular degeneration. British Journal of Ophthalmology. 97 (11), 1443-1446 (2013).
- Mettu, P. S., Allingham, M. J., Cousins, S. W. Incomplete response to Anti-VEGF therapy in neovascular AMD: Exploring disease mechanisms and therapeutic opportunities. Progress in Retinal and Eye Research. 82, 100906 (2021).
- Otsuji, T., et al. Initial non-responders to ranibizumab in the treatment of age-related macular degeneration (AMD). Clinical Ophthalmology (Auckland, N.Z). 7, 1487-1490 (2013).
- Cobos, E., et al. Association between CFH, CFB, ARMS2, SERPINF1, VEGFR1 and VEGF polymorphisms and anatomical and functional response to ranibizumab treatment in neovascular age-related macular degeneration. Acta Ophthalmologica. 96 (2), e201-e212 (2018).
- Kitchens, J. W., et al. A pharmacogenetics study to predict outcome in patients receiving anti-VEGF therapy in age related macular degeneration. Clinical Ophthalmology (Auckland, N.Z.). 7, 1987-1993 (2013).
- Rosenfeld, P. J., Shapiro, H., Tuomi, L., Webster, M., Elledge, J., Blodi, B. Characteristics of patients losing vision after 2 Years of monthly dosing in the phase III Ranibizumab clinical trials. Ophthalmology. 118 (3), 523-530 (2011).
- Spaide, R. F. Optical coherence tomography angiography signs of vascular abnormalization with antiangiogenic therapy for choroidal neovascularization. American Journal of Ophthalmology. 160 (1), 6-16 (2015).
- Lumbroso, B., Rispoli, M., Savastano, M. C., Jia, Y., Tan, O., Huang, D. Optical coherence tomography angiography study of choroidal neovascularization early response after treatment. Developments in Ophthalmology. 56, 77-85 (2016).
- Zhu, L., et al. Combination of apolipoprotein-A-I/apolipoprotein-A-I binding protein and anti-VEGF treatment overcomes anti-VEGF resistance in choroidal neovascularization in mice. Communications Biology. 3 (1), 386 (2020).
- Zhang, Z., Shen, M. M., Fu, Y. Combination of AIBP, apoA-I, and Aflibercept overcomes anti-VEGF resistance in neovascular AMD by inhibiting arteriolar choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (12), 2 (2022).
- Koehn, D., Meyer, K. J., Syed, N. A., Anderson, M. G. Ketamine/Xylazine-induced corneal damage in mice. PloS One. 10 (7), e0132804 (2015).
- Li, X. -. T., Qin, Y., Zhao, J. -. Y., Zhang, J. -. S. Acute lens opacity induced by different kinds of anesthetic drugs in mice. International Journal of Ophthalmology. 12 (6), 904-908 (2019).
- Zhou, T. E., et al. Preventing corneal calcification associated with xylazine for longitudinal optical coherence tomography in young rodents. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (1), 461-469 (2017).
- Ikeda, W., Nakatani, T., Uemura, A. Cataract-preventing contact lens for in vivo imaging of mouse retina. BioTechniques. 65 (2), 101-104 (2018).
- Kumar, S., Berriochoa, Z., Jones, A. D., Fu, Y. Detecting abnormalities in choroidal vasculature in a mouse model of age-related macular degeneration by time-course indocyanine green angiography. Journal of Visualized Experiments. 84, e51061 (2014).
