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Summary

Atualmente, a angiografia fluoresceínica (AF) é o método preferido para identificar padrões de vazamento em modelos animais de neovascularização de coroide (CNV). Entretanto, a AF não fornece informações sobre a morfologia vascular. Este protocolo descreve o uso da angiografia verde com indocianina (ICGA) para caracterizar diferentes tipos de lesões de CNV induzida por laser em modelos de camundongos.

Abstract

A degeneração macular relacionada à idade (DMRI) é uma das principais causas de cegueira entre indivíduos mais velhos, e sua prevalência está aumentando rapidamente devido ao envelhecimento da população. A neovascularização da coroide (NVC) ou DMRI úmida, responsável por 10%-20% de todos os casos de DMRI, é responsável por alarmantes 80%-90% da cegueira relacionada à DMRI. As terapias anti-VEGF atuais mostram respostas subótimas em aproximadamente 50% dos pacientes. A resistência ao tratamento anti-VEGF em pacientes com CNV está frequentemente associada à CNV arteriolar, enquanto os respondedores tendem a ter CNV capilar. Embora a angiografia fluoresceínica (AF) seja comumente usada para avaliar padrões de vazamento em pacientes com DMRI úmida e modelos animais, ela não fornece informações sobre a morfologia vascular da NVC (CNV arteriolar vs. CNV capilar). Este protocolo introduz o uso da angiografia verde com indocianina (ICGA) para caracterizar tipos de lesões em modelos de CNV induzida por laser. Este método é crucial para investigar os mecanismos e estratégias de tratamento da resistência anti-VEGF na DMRI úmida. Recomenda-se incorporar ICGA ao lado de FA para avaliação abrangente de vazamento e características vasculares da CNV em estudos mecanísticos e terapêuticos.

Introduction

A degeneração macular relacionada à idade (DMRI) é uma condição prevalente que leva à perda grave da visão em indivíduos idosos¹. Somente nos Estados Unidos, o número de pacientes com DMRI deve dobrar, chegando a quase 22 milhões até 2050, em comparação com os atuais 11 milhões. Globalmente, espera-se que o número estimado de casos de DMRI atinja impressionantes 288 milhões até 2040².

A neovascularização da coroide (NVC), também conhecida como DMRI “úmida” ou neovascular, pode ter efeitos devastadores na visão devido à formação de vasos sanguíneos anormais abaixo da retina central. Isso leva a hemorragia, exsudação da retina e perda significativa da visão. A introdução de terapias antifator de crescimento endotelial vascular (VEGF), que têm como alvo o VEGF extracelular, revolucionou o tratamento da CNV. No entanto, apesar desses avanços, até 50% dos pacientes apresentam respostas subótimas a essas terapias, com atividade contínua da doença, como acúmulo de líquidos e^{hemorragias não} resolvidas ou novas 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14.

Estudos clínicos têm indicado que a resistência anti-VEGF em pacientes com NVC frequentemente corresponde à presença de CNV arteriolar, caracterizada por arteríolas ramificadas de grande calibre, alças vasculares e conexões anastomóticas⁹. O tratamento repetido com anti-VEGF pode contribuir para a anormalização dos vasos, o desenvolvimento de CNV arteriolar e, finalmente, a resistência às terapias anti-VEGF^14,15. Nos casos de NVC arteriolar, o extravasamento de líquido persistente é provavelmente devido à exsudação aumentada causada por tight junctions inadequadamente formadas nas alças anastomóticas arteriovenosas, particularmente em condições de alto fluxo sanguíneo⁹. Por outro lado, indivíduos que respondem bem ao tratamento anti-VEGF tendem a apresentar CNV capilar.

Em nossos estudos utilizando modelos animais, demonstramos que a CNV induzida por laser em camundongos mais velhos desenvolve CNV arteriolar e apresenta resistência ao tratamento anti-VEGF^16,17. Por outro lado, a CNV induzida por laser em camundongos mais jovens leva ao desenvolvimento de CNV capilar e alta responsividade ao tratamento anti-VEGF. Assim, é crucial diferenciar os tipos vasculares de CNV para investigações mecanicistas e terapêuticas.

Em ambientes clínicos, a CNV é comumente classificada com base nos padrões de vazamento da angiografia fluoresceínica (FA) (por exemplo, Tipo 1, Tipo 2), que usam corante fluoresceína para rastrear a exsudação e identificar áreas de vazamento patológico. Na pesquisa da DMRI, a CNV é predominantemente estudada usando FA em modelos animais. No entanto, a AF falha em revelar a morfologia vascular da NVC. Além disso, a AF capta apenas imagens no espectro da luz visível e não consegue visualizar a vasculatura coroidal abaixo do epitélio pigmentado da retina (EPR). Em contraste, o verde de indocianina (ICG), que apresenta forte afinidade pelas proteínas plasmáticas, facilita a retenção intravascular predominante e permite a visualização da estrutura vascular e do fluxo sanguíneo⁹. Ao utilizar a propriedade de fluorescência no infravermelho próximo da ICG, torna-se viável obter imagens do pigmento da retina e coroide usando a angiografia por ICG (ICGA). Neste contexto, é apresentado um protocolo que combina AF e ICGA para investigar o extravasamento e a morfologia vascular da neovascularização de coroide (CNV) induzida por laser em camundongos jovens e velhos, onde CNV capilar e arteriolar são observadas.

Protocol

Os experimentos com animais realizados neste estudo receberam aprovação dos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Baylor College of Medicine. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes descritas na Declaração da Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) para o uso de animais em pesquisas oftalmológicas e da visão. Camundongos jovens (7-9 semanas) e velhos (12-16 meses) C57BL/6J machos e fêmeas foram usados para o presente estudo. Os animais foram…

Representative Results

Seguindo o protocolo, ICGA e FA foram realizados em CNV induzida por laser em camundongos C57BL/6J jovens (7-9 semanas) e idosos (12-16 meses). A AF fornece informações sobre a localização e o vazamento das lesões de CNV (Figura 1, painéis esquerdos), enquanto a AGIC revela a morfologia vascular das lesões de CNV (Figura 1, painéis à direita). Em camundongos jovens, a CNV capilar domina as lesões da CNV. Em contraste, camundongos velhos exibem CNV arte…

Discussion

Este estudo demonstrou o uso da angiografia verde com indocianina (ICGA) para identificar a morfologia vascular da neovascularização arteriolar e capilar de coroide (CNV) em modelos murinos com CNV induzida por laser. As propriedades da luz infravermelha e ligada à hemoglobina do corante verde de indocianina (ICG) permitiram a detecção da morfologia da CNV, o que é desafiador de se conseguir usando a angiografia fluoresceínica (AF), o método atual empregado pela comunidade de pesquisa.

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Materials

32-G Insulin Syringe	MHC Medical Products	NDC 08496-3015-01
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit secondary antibody	Invitrogen	A11008
Anti-α smooth muscle Actin antibody	Abcam	ab5694
Bovine Serum Albumin	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-2323
C57BL/6J mice (7-9 weeks)	The Jackson Laboratory	Strain #:000664
Fluorescein Sodium Salt	Sigma-Aldrich	MFCD00167039
Gaymar T Pump Heat Therapy System	Gaymar	TP-500	Water circulation heat pump for mouse recovery after imaging
GenTeal Gel	Genteal	NDC 58768-791-15	Clear lubricant eye gel
GS-IB4 Alexa-Flour 568 conjugate	Invitrogen	I21412
Heidelberg Eye Explorerer	Heidelberg Engineering, Germany	HEYEX2
Indocyanine Green	Pfaultz & Bauer	I01250
Ketamine	Vedco Inc.	NDC 50989-996-06
Paraformaldehyde	Acros Organics	416785000
Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution (0.5%)	Sandoz	NDC 61314-016-01
Spectralis Multi-Modality Imaging System Heidelberg Engineering, Germany SPECTRALIS HRA+OCT Tropicamide ophthalmic solution (1%) Bausch & Lomb NDC 24208-585-64 for dilation of pupils GenTeal Gel Genteal NDC 58768-791-15 clear lubricant eye gel Ketamine Vedco Inc NDC 50989-996-06 Xylazine Lloyd Laboratories NADA 139-236 Acepromazine Vedco Inc NDC 50989-160-11 32-G Needle Steriject PRE-32013 1-ml syringe BD 309659 Indocyanine Green Pfaltz & Bauer I01250	Heidelberg Engineering, Germany	SPECTRALIS HRA+OCT
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-1L
Tropicamide ophthalmic solution (1%)	Bausch & Lomb	NDC 24208-585-64	For dilation of pupils
Xylazine	Lloyd Laboratories	NADA 139-236