Caracterización de la morfología vascular de la degeneración macular neovascular asociada a la edad mediante angiografía con verde de indocianina
Summary
Actualmente, la angiografía con fluoresceína (AF) es el método preferido para identificar patrones de fuga en modelos animales de neovascularización coroidea (NVC). Sin embargo, la AF no proporciona información sobre la morfología vascular. Este protocolo describe el uso de la angiografía con verde de indocianina (ICGA) para caracterizar diferentes tipos de lesiones de NVC inducida por láser en modelos de ratón.
Abstract
La degeneración macular asociada a la edad (DMAE) es una de las principales causas de ceguera entre las personas mayores, y su prevalencia está aumentando rápidamente debido al envejecimiento de la población. La neovascularización coroidea (NVC) o DMAE húmeda, que representa entre el 10% y el 20% de todos los casos de DMAE, es responsable de un alarmante 80%-90% de la ceguera relacionada con la DMAE. Las terapias anti-VEGF actuales muestran respuestas subóptimas en aproximadamente el 50% de los pacientes. La resistencia al tratamiento anti-VEGF en pacientes con NVC a menudo se asocia con NVC arteriolar, mientras que los respondedores tienden a tener NVC capilar. Si bien la angiografía con fluoresceína (AF) se usa comúnmente para evaluar los patrones de fuga en pacientes con DMAE húmeda y modelos animales, no proporciona información sobre la morfología vascular de las NVC (NVC arteriolar vs. NVC capilar). Este protocolo introduce el uso de la angiografía con verde de indocianina (ICGA) para caracterizar los tipos de lesiones en modelos de ratón con CNV inducida por láser. Este método es crucial para investigar los mecanismos y las estrategias de tratamiento de la resistencia a los anti-VEGF en la DMAE húmeda. Se recomienda incorporar la AGIC junto con la AF para una evaluación exhaustiva de las características vasculares y de fuga de la NVC en estudios mecanicistas y terapéuticos.
Introduction
La degeneración macular asociada a la edad (DMAE) es una afección prevalente que conduce a una pérdida grave de la visiónen personas mayores. Solo en los Estados Unidos, se prevé que el número de pacientes con DMAE se duplique, llegando a casi 22 millones para 2050, en comparación con los 11 millones actuales. A nivel mundial, se espera que el número estimado de casos de DMAE alcance la asombrosa cifra de 288 millones en 20402.
La neovascularización coroidea (NVC), también conocida como DMAE “húmeda” o neovascular, puede tener efectos devastadores en la visión debido a la formación de vasos sanguíneos anormales debajo de la retina central. Esto provoca hemorragias, exudación de la retina y pérdida significativa de la visión. La introducción de terapias anti-factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), que se dirigen al VEGF extracelular, ha revolucionado el tratamiento de las NVC. Sin embargo, a pesar de estos avances, hasta el 50% de los pacientes presentan respuestas subóptimas a estas terapias, con actividad continua de la enfermedad, como acumulación de líquidos y hemorragias nuevas o no resueltas 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14.
Estudios clínicos han indicado que la resistencia a los anti-VEGF en pacientes con NVC a menudo corresponde a la presencia de NVC arteriolar, caracterizada por arteriolas ramificadas de gran calibre, asas vasculares y conexiones anastomóticas9. El tratamiento repetido con anti-VEGF puede contribuir a la anormalidad de los vasos, al desarrollo de NVC arteriolar y, en última instancia, a la resistencia a las terapias anti-VEGF14,15. En los casos de NVC arteriolar, es probable que la fuga persistente de líquido se deba a un aumento de la exudación causada por uniones estrechas inadecuadamente formadas en las asas anastomóticas arteriovenosas, particularmente en condiciones de alto flujo sanguíneo9. Por el contrario, los individuos que responden bien al tratamiento anti-VEGF tienden a presentar NVC capilar.
En nuestros estudios con modelos animales, hemos demostrado que la NVC inducida por láser en ratones mayores desarrolla NVC arteriolar y muestra resistencia al tratamiento anti-VEGF16,17. Por el contrario, la NVC inducida por láser en ratones más jóvenes conduce al desarrollo de NVC capilar y a una alta capacidad de respuesta al tratamiento anti-VEGF. Por lo tanto, es crucial diferenciar entre los tipos vasculares de NVC tanto para investigaciones mecanicistas como terapéuticas.
En entornos clínicos, las NVC se clasifican comúnmente en función de los patrones de fuga de la angiografía con fluoresceína (por ejemplo, tipo 1, tipo 2), que utilizan un tinte de fluoresceína para rastrear la exudación e identificar áreas de fuga patológica. En la investigación de la DMAE, la CNV se estudia predominantemente utilizando la AF en modelos animales. Sin embargo, la AF no revela la morfología vascular de la NVC. Además, la AF solo captura imágenes en el espectro de luz visible y no puede visualizar la vasculatura coroidea debajo del epitelio pigmentario de la retina (EPR). Por el contrario, el verde de indocianina (ICG), que exhibe una fuerte afinidad por las proteínas plasmáticas, facilita la retención intravascular predominante y permite la visualización de la estructura vascular y el flujo sanguíneo9. Al utilizar la propiedad de fluorescencia del infrarrojo cercano de ICG, es factible obtener imágenes del pigmento de la retina y la coroides mediante angiografía ICG (ICGA). En este contexto, se presenta un protocolo que combina AF e ICGA para investigar la fuga y la morfología vascular de la neovascularización coroidea (NVC) inducida por láser en ratones jóvenes y viejos, donde se observan NVC capilares y arteriolares.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este estudio demostró el uso de la angiografía con verde de indocianina (ICGA) para identificar la morfología vascular de la neovascularización coroidea arteriolar y capilar (NVC) en modelos de ratón con NVC inducida por láser. Las propiedades de la luz infrarroja y unida a la hemoglobina del colorante verde de indocianina (ICG) permitieron la detección de la morfología de la NVC, lo que es difícil de lograr mediante la angiografía con fluoresceína (AF), el método actual empleado por la comunidad investigador…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación BrightFocus, la Fundación para la Investigación de la Retina, la Fundación Mullen y la Fundación Sarah Campbell Blaffer en Oftalmología para YF, la subvención básica de los NIH 2P30EY002520 para el Baylor College of Medicine y una subvención sin restricciones para el Departamento de Oftalmología del Baylor College of Medicine de Research to Prevent Blindness.
Materials
| 32-G Insulin Syringe | MHC Medical Products | NDC 08496-3015-01 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen | A11008 | |
| Anti-α smooth muscle Actin antibody | Abcam | ab5694 | |
| Bovine Serum Albumin | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-2323 | |
| C57BL/6J mice (7-9 weeks) | The Jackson Laboratory | Strain #:000664 | |
| Fluorescein Sodium Salt | Sigma-Aldrich | MFCD00167039 | |
| Gaymar T Pump Heat Therapy System | Gaymar | TP-500 | Water circulation heat pump for mouse recovery after imaging |
| GenTeal Gel | Genteal | NDC 58768-791-15 | Clear lubricant eye gel |
| GS-IB4 Alexa-Flour 568 conjugate | Invitrogen | I21412 | |
| Heidelberg Eye Explorerer | Heidelberg Engineering, Germany | HEYEX2 | |
| Indocyanine Green | Pfaultz & Bauer | I01250 | |
| Ketamine | Vedco Inc. | NDC 50989-996-06 | |
| Paraformaldehyde | Acros Organics | 416785000 | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution (0.5%) | Sandoz | NDC 61314-016-01 | |
| Spectralis Multi-Modality Imaging System Heidelberg Engineering, Germany SPECTRALIS HRA+OCT Tropicamide ophthalmic solution (1%) Bausch & Lomb NDC 24208-585-64 for dilation of pupils GenTeal Gel Genteal NDC 58768-791-15 clear lubricant eye gel Ketamine Vedco Inc NDC 50989-996-06 Xylazine Lloyd Laboratories NADA 139-236 Acepromazine Vedco Inc NDC 50989-160-11 32-G Needle Steriject PRE-32013 1-ml syringe BD 309659 Indocyanine Green Pfaltz & Bauer I01250 | Heidelberg Engineering, Germany | SPECTRALIS HRA+OCT | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-1L | |
| Tropicamide ophthalmic solution (1%) | Bausch & Lomb | NDC 24208-585-64 | For dilation of pupils |
| Xylazine | Lloyd Laboratories | NADA 139-236 |
References
- Fleckenstein, M., et al. Age-related macular degeneration. Nature Reviews Disease Primers. 7 (1), 1-25 (2021).
- Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 2 (2), e106-e116 (2014).
- Maguire, M. G., et al. Five-Year outcomes with anti-vascular endothelial growth factor treatment of neovascular age-related macular degeneration: the comparison of age-related macular degeneration treatments trials. Ophthalmology. 123 (8), 1751-1761 (2016).
- Yang, S., Zhao, J., Sun, X. Resistance to anti-VEGF therapy in neovascular age-related macular degeneration: a comprehensive review. Drug Design, Development and Therapy. 10, 1857-1867 (2016).
- Ehlken, C., Jungmann, S., Böhringer, D., Agostini, H. T., Junker, B., Pielen, A. Switch of anti-VEGF agents is an option for nonresponders in the treatment of AMD. Eye. 28 (5), 538-545 (2014).
- Heier, J. S., et al. Intravitreal aflibercept (VEGF trap-eye) in wet age-related macular degeneration. Ophthalmology. 119 (12), 2537-2548 (2012).
- Rofagha, S., Bhisitkul, R. B., Boyer, D. S., Sadda, S. R., Zhang, K. SEVEN-UP Study Group Seven-year outcomes in ranibizumab-treated patients in ANCHOR, MARINA, and HORIZON: a multicenter cohort study (SEVEN-UP). Ophthalmology. 120 (11), 2292-2299 (2013).
- Krebs, I., Glittenberg, C., Ansari-Shahrezaei, S., Hagen, S., Steiner, I., Binder, S. Non-responders to treatment with antagonists of vascular endothelial growth factor in age-related macular degeneration. British Journal of Ophthalmology. 97 (11), 1443-1446 (2013).
- Mettu, P. S., Allingham, M. J., Cousins, S. W. Incomplete response to Anti-VEGF therapy in neovascular AMD: Exploring disease mechanisms and therapeutic opportunities. Progress in Retinal and Eye Research. 82, 100906 (2021).
- Otsuji, T., et al. Initial non-responders to ranibizumab in the treatment of age-related macular degeneration (AMD). Clinical Ophthalmology (Auckland, N.Z). 7, 1487-1490 (2013).
- Cobos, E., et al. Association between CFH, CFB, ARMS2, SERPINF1, VEGFR1 and VEGF polymorphisms and anatomical and functional response to ranibizumab treatment in neovascular age-related macular degeneration. Acta Ophthalmologica. 96 (2), e201-e212 (2018).
- Kitchens, J. W., et al. A pharmacogenetics study to predict outcome in patients receiving anti-VEGF therapy in age related macular degeneration. Clinical Ophthalmology (Auckland, N.Z.). 7, 1987-1993 (2013).
- Rosenfeld, P. J., Shapiro, H., Tuomi, L., Webster, M., Elledge, J., Blodi, B. Characteristics of patients losing vision after 2 Years of monthly dosing in the phase III Ranibizumab clinical trials. Ophthalmology. 118 (3), 523-530 (2011).
- Spaide, R. F. Optical coherence tomography angiography signs of vascular abnormalization with antiangiogenic therapy for choroidal neovascularization. American Journal of Ophthalmology. 160 (1), 6-16 (2015).
- Lumbroso, B., Rispoli, M., Savastano, M. C., Jia, Y., Tan, O., Huang, D. Optical coherence tomography angiography study of choroidal neovascularization early response after treatment. Developments in Ophthalmology. 56, 77-85 (2016).
- Zhu, L., et al. Combination of apolipoprotein-A-I/apolipoprotein-A-I binding protein and anti-VEGF treatment overcomes anti-VEGF resistance in choroidal neovascularization in mice. Communications Biology. 3 (1), 386 (2020).
- Zhang, Z., Shen, M. M., Fu, Y. Combination of AIBP, apoA-I, and Aflibercept overcomes anti-VEGF resistance in neovascular AMD by inhibiting arteriolar choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (12), 2 (2022).
- Koehn, D., Meyer, K. J., Syed, N. A., Anderson, M. G. Ketamine/Xylazine-induced corneal damage in mice. PloS One. 10 (7), e0132804 (2015).
- Li, X. -. T., Qin, Y., Zhao, J. -. Y., Zhang, J. -. S. Acute lens opacity induced by different kinds of anesthetic drugs in mice. International Journal of Ophthalmology. 12 (6), 904-908 (2019).
- Zhou, T. E., et al. Preventing corneal calcification associated with xylazine for longitudinal optical coherence tomography in young rodents. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (1), 461-469 (2017).
- Ikeda, W., Nakatani, T., Uemura, A. Cataract-preventing contact lens for in vivo imaging of mouse retina. BioTechniques. 65 (2), 101-104 (2018).
- Kumar, S., Berriochoa, Z., Jones, A. D., Fu, Y. Detecting abnormalities in choroidal vasculature in a mouse model of age-related macular degeneration by time-course indocyanine green angiography. Journal of Visualized Experiments. 84, e51061 (2014).
