Выделение, культивирование и адипогенная индукция преадипоцитов, полученных из стромально-васкулярной фракции, из периаортальной жировой ткани мыши
Summary
В данной работе мы описываем выделение, культивирование и адипогенную индукцию преадипоцитов, полученных из стромально-васкулярной фракции, из периаортальной жировой ткани мыши, что позволяет изучать периваскулярную функцию жировой ткани и ее взаимосвязь с сосудистыми клетками.
Abstract
Периваскулярная жировая ткань (PVAT) представляет собой депо жировой ткани, которое окружает кровеносные сосуды и проявляет фенотипы белых, бежевых и коричневых адипоцитов. Недавние открытия пролили свет на центральную роль ПВАТ в регуляции сосудистого гомеостаза и участии в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний. Всестороннее понимание свойств и регуляции PVAT имеет большое значение для разработки будущих методов лечения. Первичные культуры периаортальных адипоцитов ценны для изучения функции PVAT и перекрестных помех между периаортальными адипоцитами и сосудистыми клетками. В данной работе представлен экономичный и осуществимый протокол выделения, культивирования и адипогенной индукции преадипоцитов, полученных из периаортальной жировой ткани мыши, который может быть полезен для моделирования адипогенеза или липогенеза in vitro. Протокол описывает обработку тканей и дифференцировку клеток для культивирования периаортальных адипоцитов молодых мышей. Этот протокол станет технологическим краеугольным камнем на стенде для исследования функции PVAT.
Introduction
Считается, что периваскулярная жировая ткань (PVAT), периваскулярная структура, состоящая из смеси зрелых адипоцитов и стромально-васкулярной фракции (SVF), взаимодействует со стенкой соседнего сосуда через его секретом паракринально1. Являясь важнейшим регулятором сосудистого гомеостаза, дисфункция PVAT вовлечена в патогенез сердечно-сосудистых заболеваний 2,3,4. SVF ткани адипоцитов состоит из нескольких ожидаемых клеточных популяций, включая эндотелиальные клетки, иммунные клетки, клетки мезотелия, нейрональные клетки, а также стволовые и прогениторные клетки жировой ткани (ASPC)5,6. Хорошо известно, что ASPC, находящиеся в SVF жировой ткани, могут давать начало зрелым адипоцитам5. Предполагается, что SVF является критическим источником зрелых адипоцитов в PVAT. Несколько исследований показали, что PVAT-SVF может дифференцироваться в зрелые адипоциты при определенных условиях индукции 6,7,8.
В настоящее время существуют две системы выделения SVF из жировой ткани, одна из которых является ферментативным пищеварением, а другая – неферментативной9. Ферментативные методы, как правило, приводят к более высокому выходу ядросодержащих клеток-предшественников10. На сегодняшний день широко продемонстрированы преимущества SVF в стимулировании регенерации сосудов и неоваскуляризации при заживлении ран, урогенитальных и сердечно-сосудистых заболеваниях11, особенно в дерматологии и пластической хирургии12,13. Тем не менее, перспективы клинического применения SVF, полученного из PVAT, недостаточно изучены, что может быть связано с отсутствием стандартизированного метода выделения SVF из PVAT. Целью данного протокола является установление стандартизированного подхода к выделению, культивированию и адипогенной индукции преадипоцитов, полученных из SVF-полученных из мышиного ПВАТ, окружающих грудную аорту, что позволит в дальнейшем исследовать функцию ПВАТ. Этот протокол оптимизирует методы обработки тканей и дифференцировки клеток для культивирования периаортальных адипоцитов, полученных от молодых мышей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Предложен практический и осуществимый подход к выделению и адипогенной индукции SVF-полученных преадипоцитов из периаортальной жировой ткани мыши. Преимущества этого протокола в том, что он прост и экономичен. Достаточное количество мышей имеет решающее значение для успешной изоляции…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (82130012 и 81830010) и проектами Nurture по фундаментальным исследованиям Шанхайской больницы грудной клетки (номер гранта: 2022YNJCQ03).
Materials
| 0.2 μm syringe filters | PALL | 4612 | |
| 12-well plate | Labselect | 11210 | |
| 15 mL centrifuge tube | Labserv | 310109003 | |
| 3,3',5-triiodo-L-thyronine (T3) | Sigma-Aldrich | T-2877 | 1 nM |
| 50 mL centrifuge tube | Labselect | CT-002-50A | |
| anti-adiponectin | Abcam | ab22554 | 1:1,000 working concentration |
| anti-COX IV | CST | 4850 | 1:1,000 working concentration |
| anti-FABP4 | CST | 2120 | 1:1,000 working concentration |
| anti-PGC1α | Abcam | ab191838 | 1:1,000 working concentration |
| anti-PPARγ | Invitrogen | MA5-14889 | 1:1,000 working concentration |
| anti-UCP1 | Abcam | ab10983 | 1:1,000 working concentration |
| anti-α-Actinin | CST | 6487 | 1:1,000 working concentration |
| BSA | Beyotime | ST023-200g | 1% |
| C57BL/6 mice aged 4-8 weeks of both sexes | Shanghai Model Organisms Center, Inc. | ||
| Cell Strainer 70 µm, nylon | Falcon | 352350 | |
| Collagen from calf skin | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington | LS004196 | 1 mg/mL |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | 1 μM |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693-1G | 4 mg/mL |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | 10% |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-25G | 20 mM |
| High glucose DMEM | Hyclone | SH30022.01 | |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I7018 | 0.5 mM |
| Incubator with orbital shaker | Shanghai longyue Instrument Eruipment Co.,Ltd. | LYZ-103B | |
| Insulin (cattle) | Sigma-Aldrich | 11070-73-8 | 1 μM |
| Isoflurane | RWD | R510-22-10 | |
| Krebs-Ringer's Solution | Pricella | PB180347 | protect from light |
| Microsurgical forceps | Beyotime | FS233 | |
| Microsurgical scissor | Beyotime | FS217 | |
| Oil Red O | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd | A600395-0050 | |
| PBS (Phosphate-buffered saline) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd | B548117-0500 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | 1:5,000 working concentration |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | 1:5,000 working concentration |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | 1 μM |
| Standard forceps | Beyotime | FS225 | |
| Surgical scissor | Beyotime | FS001 |
References
- Akoumianakis, I., Antoniades, C. The interplay between adipose tissue and the cardiovascular system: is fat always bad. Cardiovascular Research. 113 (9), 999-1008 (2017).
- Huang, C. L., et al. Thoracic perivascular adipose tissue inhibits VSMC apoptosis and aortic aneurysm formation in mice via the secretome of browning adipocytes. Acta Pharmacologica Sinica. 44 (2), 345-355 (2023).
- Xia, N., Li, H. The role of perivascular adipose tissue in obesity-induced vascular dysfunction. British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3425-3442 (2017).
- Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
- Ferrero, R., Rainer, P., Deplancke, B. Toward a consensus view of mammalian adipocyte stem and progenitor cell heterogeneity. Trends in Cell Biology. 30 (12), 937-950 (2020).
- Angueira, A. R., et al. Defining the lineage of thermogenic perivascular adipose tissue. Nature Metabolism. 3 (4), 469-484 (2021).
- Boucher, J. M., et al. Rab27a regulates human perivascular adipose progenitor cell differentiation. Cardiovascular Drugs and Therapy. 32 (5), 519-530 (2018).
- Saxton, S. N., Withers, S. B., Heagerty, A. M. Emerging roles of sympathetic nerves and inflammation in perivascular adipose tissue. Cardiovascular Drugs and Therapy. 33 (2), 245-259 (2019).
- Ferroni, L., De Francesco, F., Pinton, P., Gardin, C., Zavan, B. Methods to isolate adipose tissue-derived stem cells. Methods in Cell Biology. 171, 215-228 (2022).
- Senesi, L., et al. Mechanical and enzymatic procedures to isolate the stromal vascular fraction from adipose tissue: preliminary results. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 88 (2019).
- Andia, I., Maffulli, N., Burgos-Alonso, N. Stromal vascular fraction technologies and clinical applications. Expert Opinion on Biological Therapy. 19 (12), 1289-1305 (2019).
- Suh, A., et al. Adipose-derived cellular and cell-derived regenerative therapies in dermatology and aesthetic rejuvenation. Ageing Research Reviews. 54, 100933 (2019).
- Bellei, B., Migliano, E., Picardo, M. Therapeutic potential of adipose tissue-derivatives in modern dermatology. Experimental Dermatology. 31 (12), 1837-1852 (2022).
- Kraus, N. A., et al. Quantitative assessment of adipocyte differentiation in cell culture. Adipocyte. 5 (4), 351-358 (2016).
- Figueroa, A. M., Stolzenbach, F., Tapia, P., Cortés, V. Differentiation and imaging of brown adipocytes from the stromal vascular fraction of interscapular adipose tissue from newborn mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (192), (2023).
- Ma, Y., et al. Methotrexate improves perivascular adipose tissue/endothelial dysfunction via activation of AMPK/eNOS pathway. Molecular Medicine Reports. 15 (4), 2353-2359 (2017).
- Li, X., Ballantyne, L. L., Yu, Y., Funk, C. D. Perivascular adipose tissue-derived extracellular vesicle miR-221-3p mediates vascular remodeling. FASEB Journal. 33 (11), 12704-12722 (2019).
- Ruan, C. C., et al. Perivascular adipose tissue-derived complement 3 is required for adventitial fibroblast functions and adventitial remodeling in deoxycorticosterone acetate-salt hypertensive rats. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 30 (12), 2568-2574 (2010).
- Adachi, Y., et al. Beiging of perivascular adipose tissue regulates its inflammation and vascular remodeling. Nature Communications. 13 (1), 5117 (2022).
- Ye, M., et al. Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (4), 777-789 (2019).
- Stanek, A., Brożyna-Tkaczyk, K., Myśliński, W. The role of obesity-induced perivascular adipose tissue (PVAT) dysfunction in vascular homeostasis. Nutrients. 13 (11), 3843 (2021).
- Queiroz, M., Sena, C. M. Perivascular adipose tissue in age-related vascular disease. Ageing Research Reviews. 59, 101040 (2020).
- Fitzgibbons, T. P., et al. Similarity of mouse perivascular and brown adipose tissues and their resistance to diet-induced inflammation. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (4), H1425-H1437 (2011).
- Chang, L., et al. Loss of perivascular adipose tissue on peroxisome proliferator-activated receptor-γ deletion in smooth muscle cells impairs intravascular thermoregulation and enhances atherosclerosis. Circulation. 126 (9), 1067-1078 (2012).
- Piacentini, L., et al. Genome-wide expression profiling unveils autoimmune response signatures in the perivascular adipose tissue of abdominal aortic aneurysm. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (2), 237-249 (2019).
- Wang, Z., et al. RNA sequencing reveals perivascular adipose tissue plasticity in response to angiotensin II. Pharmacological Research. 178, 106183 (2022).
- Shi, K., et al. Ascending aortic perivascular adipose tissue inflammation associates with aortic valve disease. Journal of Cardiology. 80 (3), 240-248 (2022).
- Fu, M., et al. Neural crest cells differentiate into brown adipocytes and contribute to periaortic arch adipose tissue formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (8), 1629-1644 (2019).
- Gil-Ortega, M., Somoza, B., Huang, Y., Gollasch, M., Fernández-Alfonso, M. S. Regional differences in perivascular adipose tissue impacting vascular homeostasis. Trends in Endocrinology & Metabolism. 26 (7), 367-375 (2015).
- Bar, A., et al. In vivo magnetic resonance imaging-based detection of heterogeneous endothelial response in thoracic and abdominal aorta to short-term high-fat diet ascribed to differences in perivascular adipose tissue in mice. Journal of the American Heart Association. 9 (21), e016929 (2020).
