Aislamiento, cultivo e inducción adipogénica de preadipocitos derivados de la fracción vascular estromal a partir de tejido adiposo periaórtico de ratón
Summary
En este trabajo se describe el aislamiento, cultivo e inducción adipogénica de preadipocitos derivados de la fracción vascular estromal a partir de tejido adiposo periaórtico de ratón, lo que permite estudiar la función del tejido adiposo perivascular y su relación con las células vasculares.
Abstract
El tejido adiposo perivascular (PVAT) es un depósito de tejido adiposo que rodea los vasos sanguíneos y exhibe los fenotipos de los adipocitos blancos, beige y marrones. Descubrimientos recientes han arrojado luz sobre el papel central de la PVAT en la regulación de la homeostasis vascular y en la participación en la patogénesis de las enfermedades cardiovasculares. Una comprensión integral de las propiedades y la regulación de PVAT es de gran importancia para el desarrollo de futuras terapias. Los cultivos primarios de adipocitos periaórticos son valiosos para estudiar la función de PVAT y la diafonía entre los adipocitos periaórticos y las células vasculares. En este trabajo se presenta un protocolo económico y factible para el aislamiento, cultivo e inducción adipogénica de preadipocitos derivados de la fracción vascular estromal a partir de tejido adiposo periaórtico de ratón, que puede ser útil para modelar la adipogénesis o lipogénesis in vitro. El protocolo describe el procesamiento de tejidos y la diferenciación celular para el cultivo de adipocitos periaórticos de ratones jóvenes. Este protocolo proporcionará la piedra angular tecnológica en el banco para la investigación de la función de PVAT.
Introduction
Se cree que el tejido adiposo perivascular (PVAT), una estructura perivascular compuesta por una mezcla de adipocitos maduros y una fracción vascular estromal (SVF), interactúa con la pared del vaso adyacente a través de su secretoma paracrino1. Como regulador crítico de la homeostasis vascular, la disfunción de PVAT está implicada en la patogénesis de las enfermedades cardiovasculares 2,3,4. La SVF del tejido adipocito está formada por varias poblaciones celulares esperadas, entre las que se incluyen las células endoteliales, las células inmunitarias, las células mesoteliales, las células neuronales y las células madre y progenitoras adiposas (ASPC)5,6. Es bien sabido que las ASPC que residen en la SVF del tejido adiposo pueden dar lugar a adipocitos maduros5. Se infiere que la SVF es una fuente crítica de adipocitos maduros en PVAT. Varios estudios han demostrado que el PVAT-SVF puede diferenciarse en adipocitos maduros en condiciones específicas de inducción 6,7,8.
Actualmente, existen dos sistemas de aislamiento para aislar la SVF del tejido adiposo, uno es la digestión enzimática y el otro es no enzimático9. Los métodos enzimáticos suelen dar lugar a un mayor rendimiento de células progenitoras nucleadas10. Hasta la fecha, los beneficios de la SVF en la promoción de la regeneración vascular y la neovascularización en la cicatrización de heridas, enfermedades urogenitales y cardiovasculares han sido ampliamente demostrados11, especialmente en dermatología y cirugía plástica12,13. Sin embargo, las perspectivas de aplicación clínica de la SVF derivada de PVAT no han sido bien exploradas, lo que puede atribuirse a la falta de un método estandarizado para el aislamiento de SVF de PVAT. El objetivo de este protocolo es establecer un enfoque estandarizado para el aislamiento, cultivo e inducción adipogénica de preadipocitos derivados de la FVSP a partir de la PVAT de ratón que rodea la aorta torácica, lo que permite una mayor investigación de la función de la PVAT. Este protocolo optimiza el procesamiento de tejidos y las técnicas de diferenciación celular para el cultivo de adipocitos periaórticos obtenidos de ratones jóvenes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Proponemos un enfoque práctico y factible para el aislamiento y la inducción adipogénica de preadipocitos derivados de la FVS a partir de tejido adiposo periaórtico de ratón. Las ventajas de este protocolo son que es sencillo y económico. Un número adecuado de ratones es fundamental para un aislamiento exitoso, ya que un tejido insuficiente puede dar lugar a una baja densidad de SVF y a un mal estado de crecimiento, lo que en última instancia afecta a la eficiencia lipogénica. Además, la edad del ratón es un f…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82130012 y 81830010) y los proyectos Nurture para la investigación básica del Hospital del Tórax de Shanghái (número de subvención: 2022YNJCQ03).
Materials
| 0.2 μm syringe filters | PALL | 4612 | |
| 12-well plate | Labselect | 11210 | |
| 15 mL centrifuge tube | Labserv | 310109003 | |
| 3,3',5-triiodo-L-thyronine (T3) | Sigma-Aldrich | T-2877 | 1 nM |
| 50 mL centrifuge tube | Labselect | CT-002-50A | |
| anti-adiponectin | Abcam | ab22554 | 1:1,000 working concentration |
| anti-COX IV | CST | 4850 | 1:1,000 working concentration |
| anti-FABP4 | CST | 2120 | 1:1,000 working concentration |
| anti-PGC1α | Abcam | ab191838 | 1:1,000 working concentration |
| anti-PPARγ | Invitrogen | MA5-14889 | 1:1,000 working concentration |
| anti-UCP1 | Abcam | ab10983 | 1:1,000 working concentration |
| anti-α-Actinin | CST | 6487 | 1:1,000 working concentration |
| BSA | Beyotime | ST023-200g | 1% |
| C57BL/6 mice aged 4-8 weeks of both sexes | Shanghai Model Organisms Center, Inc. | ||
| Cell Strainer 70 µm, nylon | Falcon | 352350 | |
| Collagen from calf skin | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington | LS004196 | 1 mg/mL |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | 1 μM |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693-1G | 4 mg/mL |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | 10% |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-25G | 20 mM |
| High glucose DMEM | Hyclone | SH30022.01 | |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I7018 | 0.5 mM |
| Incubator with orbital shaker | Shanghai longyue Instrument Eruipment Co.,Ltd. | LYZ-103B | |
| Insulin (cattle) | Sigma-Aldrich | 11070-73-8 | 1 μM |
| Isoflurane | RWD | R510-22-10 | |
| Krebs-Ringer's Solution | Pricella | PB180347 | protect from light |
| Microsurgical forceps | Beyotime | FS233 | |
| Microsurgical scissor | Beyotime | FS217 | |
| Oil Red O | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd | A600395-0050 | |
| PBS (Phosphate-buffered saline) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd | B548117-0500 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | 1:5,000 working concentration |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | 1:5,000 working concentration |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | 1 μM |
| Standard forceps | Beyotime | FS225 | |
| Surgical scissor | Beyotime | FS001 |
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