Isolamento, expansão in vitro e caracterização de células-tronco mesenquimais do tecido adiposo epididimal de camundongos
Summary
O tecido adiposo é uma excelente fonte de células-tronco mesenquimais. Aqui, trazemos a extração, cultivo e caracterização passo a passo de células-tronco derivadas do tecido adiposo (ADSCs) do tecido adiposo epididimal de camundongos suíços.
Abstract
As células-tronco mesenquimais (CTMs) têm sido extensivamente estudadas como uma nova abordagem terapêutica, principalmente para interromper a inflamação exacerbada devido ao seu potencial de modular a resposta imune. As CTMs são células imunoprivilegiadas capazes de sobreviver em receptores de transplante alogênico imunologicamente incompatíveis com base na baixa expressão de moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) classe I e no uso de terapia baseada em células para transplante alogênico. Essas células podem ser isoladas de vários tecidos, sendo os mais comumente utilizados a medula óssea e os tecidos adiposos. Fornecemos um protocolo fácil para isolar, cultivar e caracterizar MSCs do tecido adiposo epididimal de camundongos. O tecido adiposo epididimal é excisado cirurgicamente, fisicamente fragmentado e digerido com solução de colagenase tipo II a 0,15%. Em seguida, células-tronco derivadas do tecido adiposo primário (ADSCs) são cultivadas e expandidas in vitro, e a caracterização fenotípica é realizada por citometria de fluxo. Também fornecemos as etapas para diferenciar as ADSCs em células osteogênicas, adipogênicas e condrogênicas, seguidas pela caracterização funcional de cada linhagem celular. O protocolo fornecido aqui pode ser usado para experimentos in vivo e ex vivo e, como alternativa, as células-tronco derivadas do tecido adiposo podem ser usadas para gerar células imortalizadas semelhantes a MSCs.
Introduction
As células-tronco mesenquimais (CTMs) são células adultas multipotenciais que se diferenciam em células como osteoblastos, condroblastos e adipócitos 1,2. Essas células residem em vários órgãos e, por isso, podem ser extraídas de tecidos adultos, como medula óssea, músculo, gordura, folículo piloso, raiz do dente, placenta, derme, pericôndrio, cordão umbilical, pulmão, fígado e baço 3,4.
Os efeitos das CTMs na fisiologia e no sistema imunológico têm sido relatados 5,6. Essas células têm sido promissoras para o tratamento de diversas doenças, tanto na medicina humana quanto veterinária. As CTMs podem controlar a inflamação e promover a angiogênese e a homeostase tecidual por meio de diferentes mecanismos, como contato célula-célula, fatores solúveis e pequenas vesículas extracelulares 7,8,9,10. Além disso, as CTMs são células imunoprivilegiadas capazes de sobreviver em receptores de transplante alogênico imunologicamente incompatíveis, pois essas células apresentam baixa expressão de moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) classe I e são utilizadas em terapia celular para transplante alogênico 11,12. A baixa imunogenicidade combinada com o potencial regenerativo torna as CTMs candidatas ideais para terapia celular, como doença do enxerto contra o hospedeiro (GvHD)13, lúpus eritematoso sistêmico (LES)14 e esclerose múltipla15, entreoutras16,17.
Apesar de as CTMs residirem em vários tecidos adultos, o tecido adiposo oferece vantagens em relação a outras fontes, como acessibilidade para a captação, com mínima intervenção cirúrgica; grande número de células disponíveis com alta taxa de expansão; e fácil expansão in vitro usando um protocolo de fácil execução, sem a necessidade de equipamentos específicos e materiais de baixo custo 18,19,20. Uma vez extraídas, as células-tronco derivadas do tecido adiposo (ADSCs) devem ser caracterizadas conforme estabelecido pela International Society for Cellular Therapy (ISCT)21. Assim, as CTMs devem apresentar morfologia semelhante a fibroblastos, aderência à cultura plástica, expressando uma alta porcentagem (≥95%) de marcadores mesenquimais, como endoglina (CD105), ecto-5′-nucleotidase (CD73) e Thy-1 (CD90), e baixa porcentagem (≤2%) de marcadores hematopoiéticos, como antígeno comum leucocitário (CD45), fosfoglicoproteína transmembrana (CD34), glicoproteína de membrana ancorada em glicolipídios (CD14), integrina alfa M (CD11b), cadeia alfa da proteína associada ao complexo receptor de antígeno de células B (CD79α) ou Antígeno de superfície de linfócitos B B4 (CD19) e antígeno leucocitário humano de classe II (HLA-II). Além disso, é necessária uma caracterização funcional, e as células devem ser capazes de se diferenciar em células osteoblásticas, condroblásticas ou adipoblásticas21.
Aqui, mostramos como obter as CTMs do tecido adiposo epididimal usando dissociação mecânica e digestão enzimática para estudos in vitro e a caracterização morfológica preconizada por ISCT.
Protocol
Representative Results
Discussion
As CTMs podem ser extraídas de diferentes tecidos. Apesar de a medula óssea representar uma fonte comum de CTMs em murinos e humanos25,26, optamos por trabalhar com tecido adiposo neste estudo devido à sua riqueza em CTMs, distribuição no corpo e facilidade de acesso. Como alternativa, as células-tronco derivadas do tecido adiposo podem ser usadas para gerar células imortalizadas semelhantes a MSCs27.
Alg…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Pesquisa apoiada por bolsa do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (480807/2011-6) e Fundação de Amparo à Pesquisa de Minas Gerais (APQ-01237-11). Este estudo foi financiado em parte pelo PROPP UESC (073.6764.2019.0021079-85). MGAG e URS graças à bolsa concedida pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), respectivamente.
Materials
| 140 °C High Heat Sterilization CO2 Incubator | RADOBIO SCIENTIFIC CO. LTD, China | C180 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | I7018 | |
| Acetic acid glacial | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | PHR1748 | |
| Alcian Blue 8GX | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | A9186 | BioReagent, suitable for detection of glycoproteins. 1% in acetic acid, pH 2.5 |
| Alcohol 70% | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | 65350-M | 70% in water |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | PHR1662 | |
| Antibodies anti-mouse anti-CD29 FITC (Clone Ha2/5) | BD Biosciences, San Diego, CA, USA | 555005 | Functions in the cell: Adhesion and activation, embryogenesis, Leukocytes, DC, platelets, mast cells, fibroblasts and endothelial cells |
| Antibodies anti-mouse anti-CD34 PE (Clone RAM34) | BD Biosciences, San Diego, CA, USA | 551387 | Functions in the cell: Cell adhesion factor. Hematopoietic stem cells |
| Antibodies anti-mouse anti-CD45 APC (Clone 30-F11) | BD Biosciences, San Diego, CA, USA | 559864 | Functions in the cell: Assists in the activation of leukocytes |
| Antibodies anti-mouse anti-CD71 FITC (Clone C2) | BD Biosciences, San Diego, CA, USA | 553266 | Functions in the cell: Controls iron uptake during cell proliferation. Proliferating cells, reticulocytes and precursors |
| Antibodies anti-mouse anti-CD90 PerCP (Clone OX-7) | BD Biosciences, San Diego, CA, USA | 557266 | Functions in the cell: Signaling, adhesion. T lymphocyte, NK, monocyte, HSC, neuron, fibroblast |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | PHR1008 | |
| Automatic pipettes | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 4700850N | Finnpipette F1 Good Laboratory Pipetting (GLP) Kits |
| Beaker | Not applicable | 1 unit | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | A7906 | |
| Cell culture plates (6-well) | Merck, Darmstadt, Germany | Z707759 | 07 units sterile. TPP tissue culture plates |
| Cell culture plates (96-well. Round or V bottom) | Merck, Darmstadt, Germany | CLS353077 | 01 unit sterile. Wells, 96, Tissue Culture (TC)-treated surface, round bottom clear wells, sterile |
| Chondrogenic medium | Stem Pro Chondrogenesis Differentiation–Life Technologies | A1007101 | TGF-β2, TGF-β3, dexamethasone, insulin, transferrin, ITS, sodium-l – ascorbate, sodium pyruvate, ascorbate-2-phosphate |
| Collagenase type II | Life Technologies, California, USA | 17101015 | |
| cork or styrofoam board covered with aluminum | Not applicable | 1 unit | |
| cotton | Not applicable | 50 g | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | D4902 | |
| Dissecting scissor | Not applicable | 03 units sterile | |
| DPX Mountant for histology | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | 6522 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | D5523 | With 1000 mg/L glucose and L-glutamine, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture |
| Eosin B | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | 861006 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | F4135 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | 47608 | |
| Formalin | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | HT501128 | |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | G1397 | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | H3136 | |
| Hypodermic Needle (0.3mm x 13mm) | Not applicable | 5 units | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | I0200000 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | I3536 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | 563935 | 70% in H2O |
| Ketamine-D4 hydrochloride solution | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | K-006 | 1.0 mg/mL in methanol (as free base), certified reference material, Cerilliant® |
| Neubauer chamber | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | BR718620 | BRAND counting chamber BLAUBRAND Neubauer pattern. With clips, double ruled |
| Nichiryo pipette tips (0.1–10 μL) | Merck, Darmstadt, Germany | Z645540 | Volume range 0.1–10 μL, elongated, bulk pack. Sterile |
| Nichiryo pipette tips (1–10 mL) | Merck, Darmstadt, Germany | Z717401 | Volume range 1–10 mL, universal, bulk pack. Sterile |
| Nichiryo pipette tips (200 μL) | Merck, Darmstadt, Germany | Z645516 | Maximum volume 200 μL, graduated, ministack. Sterile |
| Oil-Red O solution | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | O1391 | 0.5% in isopropanol |
| Paraffin | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | 107.151 | 46–48, in block form |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | P4333 | Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, 0.1 μm filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Phosphate-buffered saline solution 1x (PBS). | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | P3813 | Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions. Balanced and sterile |
| Polypropylene conical tubes (15 mL) | Falcon, Fisher Scientific | 14-959-53A | Sterile |
| Polypropylene conical tubes (50 mL) | Falcon, Fisher Scientific | 14-432-22 | 2 units sterile |
| scalpel (optional) | Not applicable | 1 unit | |
| Silver nitrate | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | 85228 | |
| Sodium thiosulfate | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | 72049 | |
| Surgical tweezer (15 cm) | Not applicable | 3 units sterile | |
| Swiss male mice (6–8 weeks) | Bioterium, Santa Cruz State University | 021/22 | |
| syringe (1 mL) | Not applicable | 1 unit | |
| Trypan Blue Dye | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | T8154 | 0.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| Trypsin/EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | T3924 | |
| Xylazine | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | PHR3263 | |
| β-glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA | G9422 | BioUltra, suitable for cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99% (titration) |
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