Vi har utvecklat en metod för att bedöma om tumörer i nervsystemet hos genetiskt modifierade möss korrekt rekapitulerar patologin hos sina mänskliga motsvarigheter. Här tillämpar vi dessa histologiska tekniker, definierade patologiska kriterier och odlingsmetoder på neurofibrom och maligna perifera nervskidtumörer som uppstår i P 0-GGFβ3-musmodellen.
Patienter med det autosomalt dominanta tumörkänslighetssyndromet neurofibromatos typ 1 (NF1) utvecklar vanligtvis plexiforma neurofibrom (PN) som därefter omvandlas till mycket aggressiva maligna perifera nervskidetumörer (MPNST). Att förstå processen genom vilken en PN omvandlas till en MPNST skulle underlättas av tillgängligheten av genetiskt modifierade musmodeller (GEM) som exakt replikerar PN-MPNST-progressionen som ses hos människor med NF1. Tyvärr rekapitulerar inte GEM-modeller med Nf1-ablation helt och hållet denna process. Detta ledde oss till att utveckla P 0-GGFβ3-möss, en GEM-modell där överuttryck av Schwann-cellens mitogen neuregulin-1 (NRG1) i Schwann-celler resulterar i utveckling av PN som utvecklas till att bli MPNST med hög frekvens. Men för att avgöra om tumörgenes och neoplastisk progression hos P 0-GGFβ3-möss korrekt modellerar de processer som ses hos NF1-patienter, var vi tvungna att först bevisa att patologin hos P0-GGFβ3 perifera nervskidetumörer rekapitulerar patologin hos deras mänskliga motsvarigheter.
Här beskriver vi de specialiserade metoder som används för att korrekt diagnostisera och gradera tumörer i perifera nervsystemet i GEM-modeller, med hjälp av P 0-GGFβ3 och P0-GGFβ3; Trp53+/- möss som exempel. Vi beskriver de histologiska, immunhistokemiska och histokemiska metoder som används för att diagnostisera PN och MPNST, hur man skiljer dessa tumörer från andra tumörtyper som efterliknar deras patologi och hur man graderar dessa neoplasmer. Vi diskuterar etablering av tidiga passagekulturer från GEM MPNSTs, hur man karakteriserar dessa kulturer med hjälp av immunocytokemi och hur man verifierar deras tumörigenicitet genom att etablera allograft. Sammantaget karakteriserar dessa tekniker patologin hos PN och MPNST som uppstår i GEM-modeller och jämför kritiskt patologin hos dessa murina tumörer med deras mänskliga motsvarigheter.
Under de senaste tre decennierna har många laboratorier försökt skapa musmodeller av mänsklig cancer genom att introducera mänskliga cancerassocierade mutationer i musgenomet eller genom att överuttrycka en genprodukt som överuttrycks i mänsklig cancer. De resulterande genetiskt modifierade musmodellerna (GEM) kan användas för en mängd olika ändamål, såsom att fastställa att den nyligen introducerade genomiska modifieringen initierar tumörbildning, identifiera andra efterföljande genetiska eller epigenetiska förändringar som bidrar till tumörprogression och definiera de viktigaste signalvägarna som driver tumörinitiering och progression. Till skillnad från ortotopiska xenograftmodeller, som bygger på användning av möss med immunbrist, har GEM-cancermodeller ett fullt fungerande immunsystem och modellerar därför mer exakt svar på potentiella terapeutiska medel. Men när man använder GEM-cancermodeller för ändamål som dessa är det viktigt att utredarna bekräftar att observationer som gjorts med GEM-tumörer är relevanta för deras mänskliga motsvarigheter. Denna validering bör innefatta en grundlig bedömning av GEM-neoplasmernas patologi och en bestämning av huruvida de patologiska egenskaperna hos GEM-neoplasmerna rekapitulerar patologin hos motsvarande humana tumörtyp.
Tumörkänslighetssyndromet neurofibromatos typ 1 (NF1) är den vanligaste genetiska sjukdomen som påverkar det mänskliga nervsystemet och förekommer hos ungefär 1 av 3 000-3 500 levande födda 1,2,3. Individer som drabbas av NF1 utvecklar flera godartade perifera nervskidetumörer som kallas neurofibrom i huden (dermalt neurofibrom) och i stora nerver och nervplexus (plexiforma neurofibrom). Medan både dermala och plexiforma neurofibrom försämrar patientens livskvalitet genom att ge fysiska, beteendemässiga och/eller sociala funktionsnedsättningar, är plexiforma neurofibrom (PN) särskilt farliga 4,5. Detta beror på att PN ofta omvandlas till maligna perifera nervskidetumörer (MPNST), som är aggressiva spindelcellstumörer med en exceptionellt låg överlevnadsgrad 1,2. Till stor del beror denna låga överlevnad på att de radio- och kemoterapeutiska regimer som för närvarande används för att behandla MPNST är ineffektiva. Att utveckla nya, mer effektiva terapier har dock varit utmanande. Detta beror på att, trots hur vanligt MPNST förekommer hos NF1-patienter, är de fortfarande sällsynta tumörer. Som ett resultat är det mycket svårt att få ett stort antal mänskliga tumörer för studier; Det är också en utmaning att rekrytera tillräckligt många patienter med MPNST för kliniska prövningar. För att övervinna dessa begränsningar har flera GEM-modeller genererats med målet att få ytterligare insikter om de avvikelser som driver neurofibrompatogenes och PN-MPNST-progression och för att underlätta prekliniska prövningar med läkemedelskandidater.
NF1-patienter har inaktiverande mutationer i en kopia av NF1-genen. Neurofibrompatogenes utlöses när en inaktiverande mutation i den återstående funktionella NF1-genen inträffar i en cell i Schwann-cellinjen. Förvånansvärt nog utvecklade möss inte neurofibrom 6,7 när de genererades med könscellsinaktiverande Nf1-mutationer. Den efterföljande demonstrationen att möss med Nf1-null Schwann-celler och Nf1-haploinsufficiens i alla andra celltyper (Krox20-Cre;Nf1flox/- möss) utvecklade plexiforma neurofibrom föreslog att reducerad Nf1-gendos i ytterligare celltyper krävdes för neurofibrompatogenes8. Även då, de plexiforma neurofibromerna i Krox20-Cre; Nf1-flox/- möss utvecklades inte till att bli MPNSTs och efterliknade därför bara delvis biologin hos sina mänskliga motsvarigheter. MPNST-patogenes inträffade när Nf1-mutationer parades ihop med mutationer i ytterligare tumörsuppressorgener såsom Trp539 eller Cdkn2a10, men MPNST i dessa GEM-modeller utvecklades de novo eller från atypiska neurofibromatösa neoplasmer med osäker biologisk potential (ANNUBPs)11,12, snarare än från redan existerande benigna plexiforma neurofibrom (se13,14 för utmärkta recensioner av dessa modeller såväl som andra modeller som introducerar ytterligare MPNST-associerade funktionsmutationer i gener som Suz12 och Pten15).
Dessa musmodeller har varit ovärderliga för att fastställa den roll som gener som NF1, TP53 och CDKN2A spelar i patogenesen av NF1-associerade tumörer i perifera nervsystemet och för prekliniska prövningar som testar potentiella terapeutiska medel. Vi har dock fortfarande en ofullständig förståelse för den process genom vilken plexiforma neurofibrom utvecklas till att bli atypiska neurofibromatösa neoplasmer med osäker biologisk potential (ANNUBPs16) och sedan MPNST. Vissa framsteg har nyligen gjorts för att förstå denna process med den senaste rapporten att möss med deletioner i Nf1 och Arf utvecklar ANNUBPs som utvecklas till att bli MPNST11. Det finns dock ännu inga Nf1-mutationsbaserade musmodeller som helt rekapitulerar processen för plexiform neurofibrom-MPNST-progression som ses hos människor. Dessutom är det inte klart om det finns flera distinkta vägar som leder till utvecklingen av MPNST. Med tanke på detta är det möjligt att de GEMs som beskrivs ovan endast modellerar en delmängd av flera olika vägar som leder till neurofibrom-MPNST-progression och MPNST-patogenes. Detta understryks av det faktum att MPNST också förekommer sporadiskt och att vissa sporadiska MPNST uppenbarligen inte har NF1-mutationer 17,18.
Även om den senare punkten har ifrågasatts av Magollon-Lorenz et al.’s senaste förslag att åtminstone några sporadiska MPNST som saknar NF1-mutationer är melanom eller en annan typ av sarkom19, har vi nyligen rapporterat en sporadisk MPNST och en cellinje härledd från denna tumör (2XSB-celler) som var NF1 vildtyp20. Under karakteriseringen av modertumören och 2XSB-cellinjen uteslöt vi systematiskt alternativa diagnostiska möjligheter, inklusive melanom och de många andra sarkomtyper som rutinmässigt beaktas vid differentialdiagnos av en sporadisk malign perifer nervskidetumör20. Dessutom noterar vi att Magollon-Lorenz et al. erkände att deras fynd i de tre sporadiska MPNST-cellinjerna som de studerade inte kunde generaliseras för att indikera att alla tumörer som identifierats som sporadiska MPNST inte är MPNST.
För att konstruera en GEM-modell där neurofibrom och MPNST-patogenes inte nödvändigtvis var beroende av specifika tumörsuppressorgenmutationer, genererade vi transgena möss där överuttryck av den potenta Schwann-cellens mitogen neuregulin-1 (NRG1) drevs av Schwann-cellspecifik myelinprotein noll (P0) promotor (P 0-GGFβ3 möss)21. Vi har tidigare visat att humana neurofibrom, MPNSTs och MPNST-cellinjer uttrycker flera NRG1-isoformer tillsammans med erbB-receptortyrosinkinaser (erbB2, erbB3 och erbB4) som medierar NRG1-signalering och att dessa erbB-receptorer är konstitutivt aktiverade22. Vi har också visat att farmakologiska hämmare av erbB-kinaserna kraftigt hämmar MPNST-proliferation22, överlevnad23 och migration24. I enlighet med våra observationer på människor utvecklar P 0-GGFβ3-möss plexiforma neurofibrom25 som utvecklas till MPNST vid en hög frekvens 21,25. Vi har visat att P 0-GGFβ3 MPNSTs, liksom deras mänskliga motsvarigheter, ofta utvecklar mutationer av Trp53 och Cdkn2a, liksom många andra genomiska abnormiteter som potentiellt bidrar till tumörbildning25. MPNST som uppstår i P 0-GGFβ3-möss har inga inaktiverande Nf1-mutationer. Men med hjälp av genetisk komplementering visade vi att NRG1 främjar tumörbildning hos P 0-GGFβ3-möss huvudsakligen genom samma signalkaskader som förändras av Nf1-förlust 26; denna slutsats är baserad på vår upptäckt att ersätta NRG1-överuttryck för Nf1-förlust i närvaro av Trp53-haploinsufficiens (P 0-GGFβ3;Trp53+/- möss) producerar djur där MPNST utvecklas de novo, vilket ses i cis-Nf1+/-; Trp53+/- möss27.
För att erhålla denna och annan information som visar att P 0-GGFβ3-möss exakt modellerar processerna för neurofibrompatogenes och neurofibrom-MPNST-progression som ses hos människor med NF1, har vi utvecklat specialiserade metoder för bearbetning av vävnader från dessa djur, korrekt diagnostisering av deras tumörer, gradering av MPNST som uppstår i dessa möss, etablering och karakterisering av tidig passage P0-GGFβ3 och P0-GGFβ3; Trp53+/- MPNST-kulturer och kritiskt jämföra patologin för P 0-GGFβ3 PN och MPNST och P0-GGFβ3; Trp53+/- MPNST till sina mänskliga motsvarigheter. Många av dessa metoder är generaliserbara till andra GEM-modeller för nervsystemets neoplasi. Dessutom är flera av dessa metoder mer allmänt tillämpliga på GEM-modeller där tumörer uppstår i andra organ. Därför presenterar vi här en detaljerad beskrivning av dessa metoder.
De histologiska och biokemiska metoder som presenteras här ger ett ramverk för att diagnostisera och karakterisera GEM-modeller av neurofibrom och MPNST-patogenes. Under årens lopp har vi funnit att dessa metoder är mycket användbara för att bedöma patologin hos perifera nervskidasktumörer som uppstår i GEM-modeller 21,25,26. Men även om protokollen som beskrivs här är användbara för att bestämma hur exakt tumöre…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av anslag från National Institute of Neurological Diseases and Stroke (R01 NS048353 och R01 NS109655 till S.L.C.; R01 NS109655-03S1 till D.P.J.), National Cancer Institute (R01 CA122804 till S.L.C.) och försvarsdepartementet (X81XWH-09-1-0086 och W81XWH-12-1-0164 till S.L.C.).
100 mm Tissue Culture Plates | Corning Falcon | 353003 | |
3, 3'- Diaminobensidine (DAB) | Vector Laboratories | SK-400 | |
6- well plates | Corning Costar | 3516 | |
Acetic Acid | Fisher Scientific | A38-212 | |
Alexa Fluor 488 Secondary (Goat Anti-Mouse) | Invitrogen | A11029 | |
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Mouse) | Invitrogen | A21043 or A11004 | |
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Rabbit) | Invitrogen | A11036 | |
Ammonium Chloride (NH4Cl) | Fisher Scientific | A661-500 | |
BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
Caldesmon | ABCAM | E89, ab32330 | |
CD117 | Cell Marque | 117R-18-ASR | |
CD163 | Leica | NCL-L-CD163 | |
CD31 | ABCAM | ab29364 | |
CD34 | ABCAM | ab81289 | |
CD86 | ABCAM | ab53004 | |
Cell Scraper | Sarstedt | 83.183 | |
Cell Stripper | Corning | 25-056-CI | |
Circle Coverslip | Fisher Scientific | 12-545-100 | |
Citrisolve Hybrid (d-limonene-based solvent) | Decon Laboratories | 5989-27-5 | |
Critic Acid | Fisher Scientific | A104-500 | |
Cytokeratin | ABCAM | C-11, ab7753 | |
Desmin | Agilent Dako | clone D33 (M0760) | |
Diaminobensizdine (DAB) Solution | Vector Laboratories | SK-4100 | |
DMEM | Corning | 15-013-CV | |
Eosin Y | Thermo Scientific | 7111 | |
Ethanol (200 Proof) | Decon Laboratories | 2716 | |
Fetal Calf Serum | Omega Scientific | FB-01 | |
Forksolin | Sigma-Aldrich | F6886 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279 | |
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-022-CV | |
Harris Hematoxylin | Fisherbrand | 245-677 | |
Hemacytometer | Brightline-Hauser Scientific | 1490 | |
Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | 327-500 | |
Iba1 | Wako Chemicals | 019-19741 | |
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit ,Mouse on Mouse | Vector Laboratories | MP-2400 | |
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit, Horse Anti-Rabbit | Vector Laboratories | MP-7401 | |
Incubator | Thermo Scientific | Heracell 240i CO2 incubator | |
Isoflurane | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
Isopropanol | Fisher Scientific | A415 | |
Ki-67 | Cell Signaling | 12202 | |
Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017015 | |
Liquid Nitrogen | |||
MART1 | ABCAM | M2-9E3, ab187369 | |
Microtome | |||
Nestin | Millipore | Human: MAD5236 (10C2), Human:MAB353 (Rat-401) | |
Neuregulin 1 beta | In house | Made by S.L.C. (also available as 396-HB-050/CF from R&D Systems) | |
Neurofibromin | Santa Cruz Biotechnology | sc-67 | |
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ mice | Jackson Laboratory | 5557 | |
Nonfat Dry Milk | Walmart | Great Value Brand | |
P0-GGFβ3 mice | In house | ||
Paraffin Wax | Leica | Paraplast 39601006 | |
Parafilm M | Sigma-Aldrich | PM-999 | |
Paraformaldehyde (4%) | Thermo Scientific | J19943-K2 | |
Permount (Xylene Mounting Medium) | Fisher Scientific | SP15-100 | |
pH Meter | Mettler Toldedo | Seven Excellence, 8603 | |
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco's) | Corning | 20-031-CV | |
PMEL | ABCAM | EP4863(2), ab137078 | |
Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P5899-5MG | |
Portable Isoflurance Machine | VetEquip Inhalation Anesthesia Systems | ||
PVA-DABCO (Aqueous Mounting Medium) | Millipore Sigma | 10981100ML | |
Rice Cooker | Beech Hamilton | ||
S100B | Agilent Dako | Z0311 (now GA504) | |
SMA | Ventana Medical Systems | clone 1A4 | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | S640 | |
Sodium Citrate (Dihydrate) | Fisher Scientific | BP327-1 | |
Sox10 | ABCAM | ab212843 | |
Steel histology mold | |||
Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
TCF4/TCFL2 | Cell Signaling | (CH48H11) #2569 | |
Tissue Cassette | |||
Toluidine Blue | ACROS Organics | 348600050 | |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
TRIzol | Invitrogen | 15596026 | |
Trypsin | Corning | 25-051-31 |