Monitoraggio del rilascio di miRNA nelle vescicole extracellulari utilizzando la citometria a flusso
Summary
In questo articolo, descriviamo un protocollo semplice che consente la valutazione in vitro dell’abbondanza di microRNA marcati con fluorescenza per studiare le dinamiche dell’impacchettamento e dell’esportazione dei microRNA in vescicole extracellulari (EV).
Abstract
Le vescicole extracellulari (EV) sono importanti mediatori della comunicazione cellulare che vengono secreti da una varietà di cellule diverse. Queste vescicole extracellulari trasportano molecole bioattive, tra cui proteine, lipidi e acidi nucleici (DNA, mRNA, microRNA e altri RNA non codificanti), da una cellula all’altra, portando a conseguenze fenotipiche nelle cellule riceventi. Di tutti i vari carichi di EV, i microRNA (miRNA) hanno attirato una grande attenzione per il loro ruolo nel modellare il microambiente e nell’educare le cellule riceventi a causa della loro chiara disregolazione e abbondanza nelle EV. Ulteriori dati indicano che molti miRNA sono attivamente caricati nelle vescicole extracellulari. Nonostante questa chiara evidenza, la ricerca sulle dinamiche di esportazione e sui meccanismi di smistamento dei miRNA è limitata. Qui, forniamo un protocollo che utilizza l’analisi della citometria a flusso di EV-miRNA che può essere utilizzato per comprendere le dinamiche del carico di EV-miRNA e identificare i meccanismi coinvolti nell’esportazione di miRNA. In questo protocollo, i miRNA predeterminati per essere arricchiti in vescicole extracellulari e impoveriti dalle cellule donatrici vengono coniugati a un fluoroforo e trasfettati nelle cellule donatrici. I miRNA marcati con fluorescenza vengono quindi verificati per il caricamento nelle vescicole extracellulari e la deplezione dalle cellule utilizzando qRT-PCR. Sia come controllo della trasfezione che come strumento per il gating della popolazione di cellule trasfettate, è incluso un RNA cellulare marcato in modo fluorescente (trattenuto dalle cellule e impoverito di EV). Le cellule trasfettate sia con il miRNA EV che con il miRNA trattenuto dalle cellule vengono valutate per i segnali fluorescenti nel corso di 72 ore. L’intensità del segnale di fluorescenza specifica per i miRNA EV diminuisce rapidamente rispetto al miRNA trattenuto dalle cellule. Utilizzando questo semplice protocollo, è ora possibile valutare la dinamica del carico di miRNA e identificare vari fattori responsabili del caricamento dei miRNA nelle vescicole extracellulari.
Introduction
I microRNA (miRNA) sono uno dei sottoinsiemi meglio caratterizzati di piccoli RNA non codificanti, noti per il loro ruolo critico nella regolazione genica post-trascrizionale. L’espressione e la biogenesi della maggior parte dei miRNA seguono una serie coordinata di eventi che inizia con la trascrizione dei miRNA primari (pri-miRNA) nel nucleo. A seguito dell’elaborazione nucleare da parte del complesso microprocessore in miRNA precursori (pre-miRNA), i pre-miRNA vengono esportati nel citoplasma, dove subiscono un’ulteriore elaborazione da parte dell’endonucleasi RNasi III, suddividendosi in duplex di miRNA maturi a 21-23 nucleotidi1. Uno dei filamenti del miRNA maturo processato si lega agli RNA messaggeri bersaglio (mRNA), portando alla degradazione o alla repressione traduzionale dei bersagli2. Sulla base del ruolo pleiotropico dei miRNA nella regolazione simultanea di più mRNA bersaglio diversi, non sorprende che l’espressione dei miRNA sia strettamente regolata3. In effetti, l’espressione inappropriata contribuisce a vari stati patologici, soprattutto nel cancro. L’espressione aberrante dei miRNA non solo rappresenta una firma specifica della malattia, ma è anche emersa come bersaglio per il potenziale prognostico e terapeutico 4,5,6. Oltre ai loro ruoli intracellulari, i miRNA hanno anche ruoli non autonomi. Ad esempio, i miRNA possono essere impacchettati selettivamente in vescicole extracellulari dalle cellule donatrici ed esportati nei siti riceventi dove suscitano diverse risposte fenotipiche nella fisiologia normale e della malattia 7,8,9.
Nonostante la chiara evidenza che i miRNA associati alle EV sono biomolecole funzionali, non è completamente chiaro come specifici sottoinsiemi di miRNA siano disregolati in stati patologici come il cancro e come il macchinario cellulare selezioni e selezioni i miRNA in Evs10,11. Dato il potenziale ruolo dei miRNA EV nella modulazione del microambiente, è fondamentale identificare i meccanismi coinvolti nell’esportazione di miRNA selezionati per chiarire completamente il ruolo degli EV nella comunicazione intercellulare e nella patogenesi della malattia. Comprendere il processo di rilascio di miRNA nelle vescicole extracellulari non solo evidenzierà importanti mediatori dell’esportazione di miRNA, ma può anche fornire informazioni su potenziali terapie. Per raggiungere questo livello di conoscenza, è necessario adattare gli strumenti per affrontare fedelmente queste nuove domande sperimentali. In effetti, gli studi che valutano le vescicole extracellulari stanno crescendo in modo esponenziale grazie all’introduzione di nuove tecniche e controlli12,13. In relazione alla valutazione dell’abbondanza di miRNA esportati nelle vescicole extracellulari, il sequenziamento di nuova generazione e la reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa quantitativa (qRT-PCR) sono stati gli attuali strumenti standard. Sebbene questi strumenti siano utili per valutare l’abbondanza di miRNA nelle vescicole extracellulari, ci sono limitazioni alla loro sensibilità e specificità e l’utilizzo di questi approcci statici per valutare le dinamiche è insufficiente. Delineare le dinamiche dell’esportazione dei miRNA nelle vescicole extracellulari richiede una combinazione di strumenti specializzati. Qui, presentiamo un protocollo completo che utilizza miRNA coniugati in fluorescenza, per analizzare le dinamiche del rilascio di miRNA dalle cellule donatrici e l’incorporazione nelle vescicole extracellulari. Discutiamo anche i vantaggi e i limiti del metodo e forniamo raccomandazioni per un uso ottimale. Il metodo versatile presentato in questo articolo sarà utile ai ricercatori interessati a studiare il rilascio di miRNA nelle vescicole extracellulari e il loro potenziale ruolo nella comunicazione cellulare e nella malattia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo di nuova istituzione consente di catturare la cinetica del rilascio di miRNA nelle vescicole extracellulari dopo la trasfezione di miRNA extracellulari. L’approccio consente l’analisi simultanea di più miRNA EV e miRNA cellulari, in base alle capacità del citometro. Inoltre, sebbene l’analisi della citometria a flusso possa fornire preziose informazioni sulla biologia dei miRNA EV, non è priva di limitazioni. Tuttavia, alcune delle limitazioni possono essere superate se utilizzate in combinazione con alt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Riconosciamo il supporto e la consulenza della Dott.ssa Jill Hutchcroft, Direttore della Flow Cytometry Core Facility presso la Purdue University. Questo lavoro è stato sostenuto da R01CA226259 e R01CA205420 ad A.L.K., un premio per l’innovazione dell’American Lung Association (ANALA2023) IA-1059916 ad ALK, una sovvenzione della Purdue Shared Resource Facility P30CA023168 e una borsa di studio di dottorato Fulbright assegnata dal Dipartimento di Stato, USA a S.H.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 15 mL Falcon tubes | Corning | 352097 | |
| 6-well clear flat bottom surface treated tissue culture plates | Fisher Scientific | FB012927 | |
| ApogeeMix 25 mL, (PS80/110/500 & Si180/240/300/590/880/1300 nm) | Apogee Flow Systems | 1527 | To set up gating and parameters for particle detection |
| Attune Nxt Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | N/A | For fluorescence analysis in EVs |
| BD Fortessa Cell Analyzer | BD Biosciences | N/A | For fluorescence analysis in cells |
| Cell culture incubator | N/A | N/A | Maintaining temperature of 37 °C and 5% CO2 |
| Cell Culture medium | N/A | N/A | specific for the cell-line of interest |
| Cell line of interest | N/A | N/A | Any cell line tested and evaluated for EV and cellular abundance of miRNAs on interest. |
| Cell-miRNA (miRIDIAN microRNA Mimic Red Transfection Control) | Horizon discovery | CP-004500-01-05 | miRNAs predetermined to be retained by the cell-line of interest and not selectively exported out into EVs |
| EV-miRNA (Fluorophore conjugated miRNAs) | Integrated DNA Technologies (IDT) | miRNAs predetermined to be selectively sorted into EVs | |
| Fluorescence microscope | N/A | N/A | |
| Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium | Fisher Scientific | 31-985-070 | |
| Hausser Scientific Hemocytometer | Fisher | 02-671-54 | |
| Hyclone 1x PBS (for cell culture) | Fisher | SH30256FS | |
| Lipofectamine RNAimax | Fisher Scientific | 13-778-150 | |
| miRCURY LNA Reverse Transcriptase | Qiagen | 339340 | |
| miRCURY LNA SYBR Green PCR | Qiagen | 339347 | |
| mirVana RNA Isolation | Qiagen | AM1561 | |
| Nuclease free water | Fisher Scientific | 4387936 | |
| Paraformaldehyde, 4% in PBS | Fisher | AAJ61899AK | |
| Reagent reservoir nonsterile | VWR | 89094-684 | |
| Thermo ABI QuantiStudio DX Real-Time PCR | ThermoFisher Scientific | N/A | |
| Trypsin 0.25% | Fisher | SH3004201 | |
| Ultracentrifuge | N/A | N/A |
References
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