フローサイトメトリーを用いた細胞外小胞へのmiRNA放出の追跡
Summary
ここでは、マイクロRNAパッケージングと細胞外小胞(EV)への輸出のダイナミクスを研究するために、蛍光標識されたマイクロRNAの存在量の in vitro 評価を可能にする簡単なプロトコルについて説明します。
Abstract
細胞外小胞(EV)は、さまざまな細胞から分泌される細胞間コミュニケーションの重要なメディエーターです。これらのEVは、タンパク質、脂質、核酸(DNA、mRNA、マイクロRNA、その他のノンコーディングRNA)などの生理活性分子をある細胞から別の細胞にシャトルし、レシピエント細胞に表現型の結果をもたらします。さまざまなEVカーゴの中でも、マイクロRNA(miRNA)は、EVに明らかな調節不全と存在量があるため、微小環境の形成やレシピエント細胞の教育に果たす役割で大きな注目を集めています。追加のデータは、多くのmiRNAがEVに能動的にロードされていることを示しています。このような明確な証拠があるにもかかわらず、miRNAの輸送動態や選別機構に関する研究は限られています。ここでは、EV-miRNAローディングの動態を理解し、miRNAの輸送に関与するメカニズムを特定するために使用できる、EV-miRNAのフローサイトメトリー解析を用いたプロトコルを提供します。このプロトコルでは、EVで濃縮され、ドナー細胞から枯渇するようにあらかじめ決められたmiRNAは、蛍光色素に結合し、ドナー細胞にトランスフェクトされます。次に、蛍光標識されたmiRNAを、qRT-PCRを用いてEVへのロードと細胞からの枯渇について検証します。トランスフェクションコントロールおよびトランスフェクションされた細胞集団をゲーティングするためのツールの両方として、蛍光標識された細胞RNA(細胞保持およびEV枯渇)が含まれています。EV-miRNA と cell-retained-miRNA の両方をトランスフェクションした細胞は、72 時間にわたって蛍光シグナルについて評価されます。EV-miRNAに特異的な蛍光シグナル強度は、細胞保持miRNAと比較して急速に減少します。この簡単なプロトコルを使用することで、miRNAローディングのダイナミクスを評価し、miRNAをEVにロードするさまざまな要因を特定することができます。
Introduction
マイクロRNA(miRNA)は、転写後遺伝子制御における重要な役割で知られる低分子ノンコーディングRNAのサブセットの中でも、最もよく特徴付けられているものの1つです。ほとんどのmiRNAの発現と生合成は、核内の一次miRNA(pri-miRNA)の転写から始まる一連のイベントが調整されています。マイクロプロセッサ複合体による前駆体miRNA(pre-miRNA)への核プロセシングに続いて、pre-miRNAは細胞質に輸送され、RNase IIIエンドヌクレアーゼによってさらにプロセシングされ、21〜23ヌクレオチド成熟miRNA二本鎖にダイサーされます1。プロセシングされた成熟miRNAの鎖の1本が標的メッセンジャーRNA(mRNA)に結合し、標的の分解または翻訳抑制を引き起こします2。複数の多様な標的mRNAを同時に制御するmiRNAの多面的役割に基づけば、miRNAの発現が厳密に制御されていることは驚くべきことではありません3。実際、不適切な発現は、特に癌において、さまざまな病態の一因となります。miRNAの異常な発現は、疾患特異的な特徴を表すだけでなく、予後および治療の可能性の標的としても浮上しています4,5,6。miRNAは、細胞内での役割に加えて、非自律的な役割も担っています。例えば、miRNAはドナー細胞によって選択的にEVにパッケージ化され、レシピエント部位に輸送され、正常生理学および疾患生理学において多様な表現型応答を誘発することができる7,8,9。
EV関連miRNAが機能的な生体分子であるという明確な証拠があるにもかかわらず、miRNAの特定のサブセットが癌などの疾患状態でどのように調節不全になっているか、また細胞機構がどのようにmiRNAを選択してEvに分類するかは完全には解明されていません10,11。微小環境の調節におけるEV-miRNAの潜在的な役割を考えると、細胞間コミュニケーションと疾患の病因におけるEVの役割を完全に解明するためには、特定のmiRNAの輸送に関与するメカニズムを特定することが重要です。EVへのmiRNA放出のプロセスを理解することは、miRNA輸出の重要なメディエーターを明らかにするだけでなく、潜在的な治療法への洞察も提供することができます。このレベルの知識を得るには、これらの新しい実験的問題に忠実に取り組むようにツールを適応させる必要があります。実際、EVを評価する研究は、新しい技術や制御の導入により、指数関数的に増加しています12,13。EVに輸出されるmiRNAの豊富さを評価するには、次世代シーケンシングと定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)が現在の標準的なツールとなっています。これらのツールは、EV中のmiRNAの存在量を評価するのに有用ですが、感度や特異性には限界があり、これらの静的なアプローチで動態を評価するには不十分です。EVへのmiRNAの輸送動態を解明するには、特殊なツールを組み合わせる必要があります。ここでは、ドナー細胞からのmiRNAの放出とEVへの取り込みの動態を解析するために、蛍光標識miRNAを用いた包括的なプロトコールを紹介します。また、この方法の利点と制限についても説明し、最適な使用のための推奨事項を提供します。この論文で紹介する汎用性の高い方法は、EVへのmiRNA放出と、細胞のコミュニケーションと疾患における潜在的な役割の研究に関心のある研究者にとって有用です。
Protocol
Representative Results
Discussion
新たに確立されたプロトコルにより、EV-miRNAのトランスフェクション後のEVへのmiRNA放出の動態を捕捉することができます。このアプローチでは、サイトメーターの能力に応じて、複数のEV-miRNAと細胞miRNAの同時解析が可能になります。さらに、フローサイトメトリー解析はEV miRNAの生物学に関する貴重な洞察を提供することができますが、限界がないわけではありません。ただし、いくつかの?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
パデュー大学のフローサイトメトリーコアファシリティのディレクターであるJill Hutchcroft博士からのサポートとアドバイスに感謝します。この研究は、R01CA226259 and R01CA205420 to A.L.K.、A.L.K.のAmerican Lung Association Innovation Award(ANALA2023)IA-1059916、Purdue Shared Resource Facility grant P30CA023168、および米国国務省からH.H.に授与されたフラッグシップフルブライト博士奨学金の支援を受けました。
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 15 mL Falcon tubes | Corning | 352097 | |
| 6-well clear flat bottom surface treated tissue culture plates | Fisher Scientific | FB012927 | |
| ApogeeMix 25 mL, (PS80/110/500 & Si180/240/300/590/880/1300 nm) | Apogee Flow Systems | 1527 | To set up gating and parameters for particle detection |
| Attune Nxt Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | N/A | For fluorescence analysis in EVs |
| BD Fortessa Cell Analyzer | BD Biosciences | N/A | For fluorescence analysis in cells |
| Cell culture incubator | N/A | N/A | Maintaining temperature of 37 °C and 5% CO2 |
| Cell Culture medium | N/A | N/A | specific for the cell-line of interest |
| Cell line of interest | N/A | N/A | Any cell line tested and evaluated for EV and cellular abundance of miRNAs on interest. |
| Cell-miRNA (miRIDIAN microRNA Mimic Red Transfection Control) | Horizon discovery | CP-004500-01-05 | miRNAs predetermined to be retained by the cell-line of interest and not selectively exported out into EVs |
| EV-miRNA (Fluorophore conjugated miRNAs) | Integrated DNA Technologies (IDT) | miRNAs predetermined to be selectively sorted into EVs | |
| Fluorescence microscope | N/A | N/A | |
| Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium | Fisher Scientific | 31-985-070 | |
| Hausser Scientific Hemocytometer | Fisher | 02-671-54 | |
| Hyclone 1x PBS (for cell culture) | Fisher | SH30256FS | |
| Lipofectamine RNAimax | Fisher Scientific | 13-778-150 | |
| miRCURY LNA Reverse Transcriptase | Qiagen | 339340 | |
| miRCURY LNA SYBR Green PCR | Qiagen | 339347 | |
| mirVana RNA Isolation | Qiagen | AM1561 | |
| Nuclease free water | Fisher Scientific | 4387936 | |
| Paraformaldehyde, 4% in PBS | Fisher | AAJ61899AK | |
| Reagent reservoir nonsterile | VWR | 89094-684 | |
| Thermo ABI QuantiStudio DX Real-Time PCR | ThermoFisher Scientific | N/A | |
| Trypsin 0.25% | Fisher | SH3004201 | |
| Ultracentrifuge | N/A | N/A |
References
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